輪狀病毒腸炎患兒外周血調(diào)節(jié)性和輔助性T淋巴細(xì)胞以及相關(guān)炎癥因子的表達(dá)水平▲

薛露曦 王甜甜 聶 玲 陳光虎 梅 毅

(湖北省荊州市婦幼保健院兒科，荊州市 434020，電子郵箱：xueluxi1981@163.com)

輪狀病毒腸炎又稱為小兒秋季腹瀉，是兒科的常見病、多發(fā)病，多發(fā)生于6～24個月的兒童[1]。其主要臨床表現(xiàn)為嚴(yán)重的腹瀉，病程多為3～5 d，多具有自限性，但是在臨床上仍有一部分患兒伴有發(fā)熱、呼吸急促，甚至出現(xiàn)嚴(yán)重脫水，從而引發(fā)心臟、腎臟等多種器官損害，給患兒的生命造成嚴(yán)重威脅[2-3]。T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫反應(yīng)在輪狀病毒腸炎中有著重要的作用，在不同環(huán)境中CD4+T淋巴細(xì)胞可分化為不同的T淋巴細(xì)胞亞群，其中調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞(regulatory T lymphocyte，Treg)和輔助性T淋巴細(xì)胞(T helper lymphocyte，Th)17在輪狀病毒腸炎的發(fā)病中尤其重要[4]。近年來研究顯示，輪狀病毒腸炎患兒血清及糞便中的白細(xì)胞介素(interleukin，IL)8、IL-6等炎性因子的表達(dá)水平明顯升高，且與病情嚴(yán)重程度相關(guān)[5]。目前，有關(guān)輪狀病毒腸炎患兒外周血Treg、Th17與炎癥因子IL-4、IL-6、IL-17、γ干擾素、轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor β，TGF-β)關(guān)系的研究報道較少。本研究分析輪狀病毒腸炎患兒外周血Treg、Th17及相關(guān)炎性因子水平及臨床意義，為今后臨床上治療輪狀病毒腸炎提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2018年3月至2019年3月我院收治的64例輪狀病毒腸炎患兒作為研究組，其中男性36例、女性28例，年齡6～24(14.57±3.68)個月，病程0.5～3.0(2.2±1.5)d。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合《實用兒科診療規(guī)范》[6]中關(guān)于小兒輪狀病毒腸炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)，即年齡6～24個月，病程小于2周，大便次數(shù)明顯增多(大于10次/d)，大便呈蛋花湯或水樣，伴發(fā)熱、惡心、嘔吐等全身癥狀，糞便經(jīng)膠體金檢測輪狀病毒抗原(+)。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并嚴(yán)重肝腎功能不全者；(2)重度營養(yǎng)不良者；(3)重度脫水者；(4)藥物過敏或依從性差者；(5)其他原因?qū)е赂篂a者；(6)臨床資料不完善者。另選取60例同期于我院門診體檢的健康兒童作為對照組，其中男性34例、女性26例，年齡6～30(14.3±4.5)個月。兩組研究對象一般資料差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。兩組受試兒童家長均對本次研究知情并簽署知情同意書。本研究經(jīng)荊州市婦幼保健院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 指標(biāo)檢測 所有受試兒童(研究組在治療前采集標(biāo)本)均在清晨空腹?fàn)顟B(tài)下抽取靜脈血4 mL，置入抗凝管內(nèi)，輕輕搖勻抗凝劑與血液，1 500 r/min離心10 min，取上清液，置于-80℃環(huán)境中儲存待檢。(1)Treg和Th17的檢測：取外周血清加入CD4、CD25的抗體(美國BD公司，批號：180127、180205)，用于Treg的標(biāo)記，將標(biāo)記后的樣本經(jīng)磷酸緩沖鹽溶液洗滌后進(jìn)行固定破膜；最后加入酶標(biāo)FoxP3抗體(上海裕平生物科技公司，批號：17123034)進(jìn)行細(xì)胞的標(biāo)記，避光孵育30 min。采用流式細(xì)胞術(shù)法分離出外周血清單核細(xì)胞，在分離好的單核細(xì)胞中加入CD3、CD4的酶標(biāo)抗體(美國BD公司，批號：180211、180130)，用于Th17的標(biāo)記；將標(biāo)記后的外周血單核細(xì)胞標(biāo)本用RPMI-1640培養(yǎng)液洗滌，并加入含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，然后放入37℃恒溫箱中孵育18～20 h，培養(yǎng)后細(xì)胞及對照組避光孵育30 min，然后經(jīng)磷酸緩沖鹽溶液洗滌。最后采用FACSAriaⅡ型流式細(xì)胞儀(美國BD公司)測定細(xì)胞的熒光強(qiáng)度。(2)炎性因子的檢測：采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測血清IL-4、IL-6、IL-17、γ干擾素及TGF-β水平，試劑盒購于美國Biotechnology Systems公司(IL-4、IL-6、IL-17，批號：180105、180226)和美國R&D公司(γ干擾素、TGF-β，批號：17120925、17121819)，嚴(yán)格按說明書操作。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料以(x±s)表示，組間比較采用t檢驗；相關(guān)性分析采用Pearson檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組血清Treg和Th17水平比較 研究組血清Treg水平低于對照組，而血清Th17水平高于對照組(均P<0.05)，見表1。

表1 兩組血清Treg和Th17水平比較(x±s，%)

2.2 兩組血清炎性因子水平比較 研究組血清IL-4、IL-6、IL-17、γ干擾素、TGF-β水平均高于對照組(均P<0.05)，見表2。

表2 兩組血清炎性因子水平比較(x±s,pg/mL)

2.3 輪狀病毒腸炎患兒外周血Treg和Th17與相關(guān)炎性因子的相關(guān)性 輪狀病毒腸炎患兒外周血Treg與IL-4、IL-6、IL-17、γ干擾素、TGF-β呈負(fù)相關(guān)(均P<0.05)；Th17與IL-4、IL-6、IL-17、γ干擾素、TGF-β呈正相關(guān)(均P<0.05)。見表3。

表3 輪狀病毒腸炎患兒外周血Treg和Th17與相關(guān)炎性因子的相關(guān)性

3 討 論

輪狀病毒是一種RNA病毒，是嬰幼兒腹瀉的主要致病菌之一，引起小兒腹瀉的類型主要是A組輪狀病毒。輪狀病毒腸炎是兒科常見的傳染性腸道疾病，多發(fā)生在秋冬季節(jié)，主要以糞便途徑傳播，輪狀病毒通過感染小腸上皮細(xì)胞導(dǎo)致細(xì)胞受損，從而引起腹瀉[7]。輪狀病毒腸炎患兒在發(fā)病早期多伴有前驅(qū)癥狀，如發(fā)熱、惡心等全身癥狀，在急性期腹瀉較嚴(yán)重時可伴有嘔吐、腹痛、腹脹等癥狀。然而該病的發(fā)病機(jī)制及免疫機(jī)制尚不清楚。目前，臨床上對該病毒引起的腹瀉尚無特異性治療方法，仍以對癥治療為主。已有的發(fā)病機(jī)制認(rèn)為，輪狀病毒首先侵犯腸道黏膜上皮，誘導(dǎo)機(jī)體發(fā)生免疫應(yīng)答(以腸道黏膜免疫為主)[8]。近年來，國內(nèi)外針對輪狀病毒感染機(jī)體細(xì)胞免疫應(yīng)答異常的研究已證實，有許多細(xì)胞免疫應(yīng)答相關(guān)因子參與炎癥的發(fā)生，且與病情有密切的關(guān)系[9-11]。

CD4+T淋巴細(xì)胞在接受抗原刺激后，可在不同條件下分化為不同的T淋巴細(xì)胞亞群，執(zhí)行不同的生物學(xué)功能[12]。CD4+T淋巴細(xì)胞在γ干擾素誘導(dǎo)下分化為Th1，分泌γ干擾素以促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生；在IL-4的誘導(dǎo)下分化為Th2，分泌IL-4以抑制炎癥反應(yīng)應(yīng)答；在IL-6和TGF-β的誘導(dǎo)下分化為Th17，分泌IL-6、IL-17，參與介導(dǎo)自身免疫性疾病和炎癥反應(yīng)的發(fā)生[13-14]。TGF-β是人體內(nèi)重要的人免疫抑制因子，具有調(diào)節(jié)免疫、促進(jìn)黏膜上皮細(xì)胞增殖等功能。在本研究中，研究組血清中IL-4、IL-6、IL-17、γ干擾素、TGF-β水平均高于對照組(P<0.05)，說明上述炎性因子是輪狀病毒腸炎重要的促進(jìn)因子，在其發(fā)病中發(fā)揮一定的作用。

Treg和Th17在健康組織中是并存的，在分化過程中有相互調(diào)節(jié)的作用，在穩(wěn)定狀態(tài)下，TGF-β促進(jìn)Treg細(xì)胞的產(chǎn)生，Treg細(xì)胞以主動方式調(diào)控機(jī)體的免疫應(yīng)答[15-16]。當(dāng)機(jī)體受到病原體侵犯時，內(nèi)源性IL-6、TGF-β促進(jìn)Th17的分化。在本研究中，研究組血清Treg水平低于對照組，而Th17水平高于對照組(P<0.05)，這提示Th17/Treg比例失衡時或可導(dǎo)致輪狀病毒腸炎的發(fā)生。機(jī)體免疫系統(tǒng)平衡的維持，常通過CD4+T淋巴細(xì)胞亞群相互抑制細(xì)胞分化和功能而完成[17-18]。在大多數(shù)自身免疫疾病中，過度分化、活化的致病T細(xì)胞和調(diào)節(jié)功能受損，都會打破正常的免疫平衡狀態(tài)，致使免疫系統(tǒng)向炎癥狀態(tài)發(fā)展，最終導(dǎo)致疾病的發(fā)生、發(fā)展[19-20]。相關(guān)分析結(jié)果顯示，輪狀病毒腸炎患兒外周血Treg與IL-4、IL-6、IL-17、γ干擾素、TGF-β呈負(fù)相關(guān)，Th17與IL-4、IL-6、IL-17、γ干擾素、TGF-β呈正相關(guān)(P<0.05)，說明輪狀病毒腸炎患兒外周血的Treg/Th17失衡比例可能與相關(guān)炎性因子水平上調(diào)有關(guān)，Treg和Th17的分化、活化相互制約，這依賴于各種相關(guān)炎性因子的相互作用。

綜上所述，輪狀病毒腸炎患兒外周血Treg降低而Th17升高，可能與相關(guān)炎性因子水平上調(diào)有關(guān)。Th17/Treg比例失衡時或可導(dǎo)致輪狀病毒腸炎的發(fā)病，因此，可通過增加Treg細(xì)胞數(shù)量及加強(qiáng)其功能，同時抑制Th17細(xì)胞分化及其功能，以調(diào)節(jié)兩者的比例可能對疾病的恢復(fù)有益。