miR-33表達與炎癥反應的關系

趙振宇

摘要：目的? 探討miR-33表達與炎癥反應的相關性。方法? 細胞培養箱中培養人單核細胞（THP-1）48～72 h后傳代，傳至3代，加入100 ng/ml佛波醇（PMA）誘導24 h分化成為巨噬細胞。采用實時熒光定量PCR技術檢測不同濃度LPS（0、1、10、100 ng/ml）以及10 ng/ml LPS不同刺激時間（0、24、36、48 h）THP-1巨噬細胞miR-33表達;另采用ELISA法檢測THP-1巨噬細胞中TNF-α、IL-6和MCP-1表達量，分析miR-33表達與炎癥反應的相關性。結果? 隨著LPS濃度（0、1、10、100 ng/ml）增加，miR-33表達、TNF-α、IL-6和MCP-1水平逐漸增加，不同濃度組miR-33表達、TNF-α、IL-6和MCP-水平比較，差異有統計學意義（P<0.05）。隨著LPS刺激時間（0、24、36 h）延長，miR-33表達逐漸上調、TNF-α、IL-6和MCP-1水平逐漸增加，36 h達到高峰，48 h逐漸下降到正常，不同時間點miR-33表達、TNF-α、IL-6和MCP-1水平比較，差異有統計學意義（P<0.05）。Pearson相關性分析顯示，miR-33表達與TNF-α、IL-6和MCP-1呈正相關（P<0.05）。結論? THP-1細胞中miR-33表達與其炎癥反應具有一定正相關性。

關鍵詞：內毒素脂多糖;微小RNA;炎癥因子;單核細胞;膿毒癥

中圖分類號：R631;Q291? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標識碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2020.02.020

文章編號：1006-1959（2020）02-0073-03

Abstract：Objective? To investigate the correlation between miR-33 expression and inflammatory response. Methods? Human mononuclear cells （THP-1） were cultured in a cell culture incubator for 48 to 72 h and then passaged to passage 3， and 100 ng / ml phorbol （PMA） was added to induce macrophage differentiation for 24 h.Detection of THP-1 macrophages miR-33 at different concentrations of LPS （0，1，10，100 ng/ml） and 10 ng/ml LPS at different stimulation times （0，24，36，48 h） using real-time PCR expression; ELISA was used to detect the expression of TNF-α， IL-6 and MCP-1 in THP-1 macrophages， and the correlation between miR-33 expression and inflammatory response was analyzed.Results? With the increase of LPS concentration （0，1，10，100 ng/ml）， the expression of miR-33， TNF-α， IL-6 and MCP-1 levels gradually increased. There were statistically significant differences in miR-33 expression， TNF-α， IL-6 and MCP- levels in different concentration groups（P<0.05）.With the extension of LPS stimulation time（0，24，36 h）， miR-33 expression gradually increased， TNF-α， IL-6 and MCP-1 levels gradually increased， peaked at 36 hours， and gradually decreased to normal at 48 h. There were statistically significant differences in miR-33 expression， TNF-α， IL-6 and MCP-1 levels at time points（P<0.05）. Pearson correlation analysis showed that miR-33 expression was positively correlated with TNF-α， IL-6 and MCP-1（P<0.05）.Conclusion? The expression of miR-33 in THP-1 cells has a positive correlation with its inflammatory response.

Key words：Endotoxin lipopolysaccharide;MicroRNA;Inflammatory factors;Monocytes;Sepsis

膿毒癥（sepsis）是一種由細菌、病毒、真菌及寄生蟲等各種病原微生物感染引起的全身性炎癥反應，其本質是機體促炎性介質過度釋放引起炎癥反應失控，導致自身免疫性病理損傷，嚴重時可以發展為多器官功能障礙綜合征（multiple organ dysfunction syndrome，MODS）[1]。膿毒癥臨床治療效果不佳、費用高昂，預后差，已成為重癥監護室非心臟病患者死亡的主要原因。近年來基于膿毒癥的病理生理，臨床采用了單克隆抗體來中和TNF-α、IL-6和MCP-1等炎癥因子新型生物療法，但其治療效果并不理想，因此有效預防、早期診斷及積極治療膿毒癥意義重大。微小RNA（microRNA，miRNA）是一種廣泛分布于真核細胞內以及病毒中，長度約為20～24個核苷酸的內源性非編碼單鏈RNA分子[2，3]。有研究表明[4，5]，miR-33a可以調控人外周血單核巨噬細胞靶基因ABCA1的表達，參與機體脂質代謝，介導動脈粥樣硬化形成。THP-1單核細胞在膿毒癥的發生發展過程中起著關鍵作用，而目前miR-33與THP-1細胞炎癥相關研究較少。本研究主要探討miR-33與TNF-α、IL-6及MCP-1表達水平的相關性，旨在探討其在膿毒血癥進展中的意義，現報道如下。

1材料與方法

1.1細胞與試劑? 研究時間：2019年2～3月。細胞：THP-1（中科院細胞生物所細胞中心）;脂多糖（LPS;Sigma，美國）;DMEM培養基、改良型RPMI-1640細胞培養基、Opti-MEM培養基（Gibco，美國）。試劑：TNF-α、MCP-1、IL-6 Human ELISA試劑盒（深圳欣博盛生物科技有限公司）。

1.2細胞培養及分組? 細胞培養：THP-1細胞于改良型RPMI-1640細胞培養基中，37℃、5% CO2細胞培養箱中培養48～72 h后傳代，傳至3代，PI單染色法檢測THP-1細胞存活率。將處于對數期THP-1單核細胞以密度為1×106/ml種植于6孔板中，每孔鋪細胞懸液2 ml，并用100 ng/ml佛波酯（PMA）誘導24 h分化成貼壁的巨噬細胞。實驗分組：①THP-1巨噬細胞隨機分為4組，分別用不同濃度的LPS（0、1、10、100 ng/ml）誘導各組細胞24 h。②THP-1巨噬細胞隨機分為4組，濃度為10 ng/ml LPS誘導各組細胞不同時間（0、24、36、48 h）。

1.3方法

1.3.1 miR-33表達? 實時熒光定量PCR法檢測miR-33表達：使用TRIzol法提取各組細胞沉淀中總RNA，紫外線分光光度定量，RNA/DNA微量分光光度計測定RNA純度。按Invitrogen逆轉錄反應試劑盒說明進行RNA逆轉錄。cDNA合成過程采用miR-33s RT特異性構建逆轉錄體系，miR-33 RT引物序列：5'-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACUUCACG-3';內參照U6 RT引物序列：5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'。miR-33 PCR擴增條件為：95℃，30 min;40個擴增循環（95℃ 8 s，64℃ 10 s，72℃ 20 s）。miR-33正向引物序列：5'-GGTTAGATCTTGCTCCAGCGGTTTG-3';反引物序列：5'-GTAAAGCTTGCCCTCCTGTTTCCTG-3'。內參照U6正向引物序列：5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3';反向引物序列：5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'，相關引物序列均由上海吉瑪制藥技術有限公司提供。miR-33以U6為內參基因，相對定量用2-ΔΔCt計算，Ct值為目的基因達到設定閾值時的PCR循環次數，目的基因相對于內參基因的相對數△△Ct=（Ct靶基因-Ct內參）處理組-（Ct靶基因-Ct內參）未處理組。

1.3.2 TNF-α、IL-6和MCP-1表達水平? 收集各組細胞上清液，采用ELISA法檢測TNF-α、IL-6和MCP-1含量，嚴格按照Human ELISA試劑盒內說明書進行試驗操作。

1.4觀察指標? 比較不同濃度組（0、1、10、100 ng/ml）中miR-33表達及TNF-α、IL-6和MCP-1水平，不同時間組（0、24、36、48 h）中miR-33表達及TNF-α、IL-6和MCP-1水平，并分析miR-33與TNF-α、IL-6和MCP-1表達水平的相關性。

1.5統計學方法? 采用SPSS 23.0 軟件進行數據分析處理，計量資料以（x±s）表示，比較采用t檢驗。采用Pearson相關分析miR-33與TNF-α、IL-6和MCP-1表達水平的關系。以P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1不同濃度組中miR-33表達比較? 隨著LPS濃度（0、1、10、100 ng/ml）增加，miR-33表達逐漸增加，不同濃度組中miR-33表達比較，差異有統計學意義（P<0.05），見圖1。

2.2不同濃度組中TNF-α、IL-6和MCP-水平比較? 隨著LPS濃度（0、1、10、100 ng/ml）增加，TNF-α、IL-6和MCP-1水平增加，不同濃度組中TNF-α、IL-6和MCP-水平比較，差異有統計學意義（P<0.05），見表1。

2.3不同時間組中miR-33表達比較? 隨著LPS刺激時間（0、24、36 h）延長，miR-33表達逐漸上調，36 h達到高峰，48 h逐漸下降到正常，不同時間組中miR-33表達比較，差異有統計學意義（P<0.05），見圖2。

2.4不同時間組中TNF-α、IL-6和MCP-1水平比較? 隨著LPS刺激時間（0、24、36 h）延長，TNF-α、IL-6和MCP-1水平逐漸增加，36 h達到高峰，48 h下降到正常水平，不同時間組中TNF-α、IL-6和MCP-1水平比較，差異有統計學意義（P<0.05），見表2。

2.5 miR-33與TNF-α、IL-6和MCP-1表達水平相關性分析? miR-33表達與TNF-α、IL-6和MCP-1呈正相關（r=0.873、0.782、0.915，P<0.05）。

3討論

膿毒癥與全身過度炎癥反應關系密切，免疫細胞激活、轉錄因子活化、炎癥因子過度釋放，進而啟動炎癥級聯反應是其發生發展的重要病理機制[6]。大量炎癥介質的釋放是導致全身炎癥反應綜合征的“中心環節”，其中IL-6和TNF-α作為快速反應炎癥因子，是啟動“瀑布樣反應”最上游的炎癥介質，一定程度上反應了病情程度以及預后[7，8]。

miRNA根據堿基互補配對原則，通過與靶基因mRNA3'末端非翻譯區特異性結合降解或抑制其翻譯，在轉錄后水平調控靶基因表達。研究表明[9]，在膿毒血癥發生發展的過程中，多種miRNA（miRNA-346、miRNA-147、miRNA-142-3p、miRNA-155、miRNA-9）參與了致炎基因表達的調控，從而影響炎癥細胞的增殖分化以及炎癥因子的產生釋放。本研究結果表明，隨著LPS濃度（0、1、10、100 ng/ml）增加，miR-33表達、TNF-α、IL-6和MCP-1水平逐漸增加，不同濃度組中miR-33表達、中TNF-α、IL-6和MCP-水平比較，差異有統計學意義（P<0.05），說明LPS能夠誘導THP-1細胞miR-33以及TNF-α、IL-6和MCP-1的表達，并呈現濃度依賴性。隨著LPS刺激時間（0、24、36 h）延長，miR-33表達逐漸上調、TNF-α、IL-6和MCP-1水平逐漸增加表達逐漸上調，36 h達到高峰，48 h逐漸下降到正常，不同時間組中miR-33表達、TNF-α、IL-6和MCP-1水平比較，差異有統計學意義（P<0.05），說明LPS能夠促進THP-1細胞miR-33以及TNF-α、IL-6和MCP-1的表達，并具有時間依賴性。Pearson相關分析顯示，miR-33表達與TNF-α、IL-6和MCP-1呈正相關（P<0.05），說明miR-33可能參與調節THP-1細胞TNF-α、IL-6和MCP-1的表達。

綜上所述，miR-33可能參與了THP-1細胞炎癥反應調控，其具體機制還有待一步研究。

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收稿日期：2019-11-20;修回日期：2019-11-28

編輯/杜帆