IL-17A rs2275913基因多態性與兒童哮喘易感性的關系

劉亞昆 韓英俊 張志偉 馬亞楠

哮喘是一種由多種細胞因子參與的慢性氣道炎癥性疾病，兒童哮喘患病率逐年上升且嚴重影響兒童生長發育[1]。哮喘的主要病理特征為氣道炎癥與氣道重塑，體內慢性炎癥可促進氣道高反應性進而促使兒童呼吸困難[2]。哮喘發生及發展過程受多種基因及環境因素調控，研究顯示基因單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism，SNP)與兒童哮喘因感性密切相關[3]。因而探討兒童哮喘與基因SNP的關系進一步揭示其發病機制對防治哮喘發生具有重要意義。白細胞介素-17A(interleukin-17A，IL-17A)是一種由輔助性T細胞17(Th17)產生的細胞因子，其可在中性粒細胞、嗜酸性粒細胞中表達并可調節免疫反應及炎性反應，研究顯示哮喘患者血清IL-17A水平明顯升高并可通過誘導、激活中性粒細胞募集于呼吸道進而參與哮喘發生及發展過程[4]。研究表明IL-17A基因rs2275913位點SNP與肺結核易感性有關，突變基因型AA可增加肺結核易感性發生風險[5]。關于IL-17A基因rs2275913位點SNP與兒童哮喘易感性的研究相對較少，因此本研究主要探討IL-17A rs2275913位點多態性與兒童哮喘易感性的關系，以期為個體化治療及預防兒童哮喘提供參考依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年3月至2018年5月本院收治的支氣管哮喘兒童98例為哮喘組，所有患兒符合支氣管哮喘診斷標準[6]，其中男59例，女39例；年齡1～6歲，平均(4.12±1.25)歲。同時選取同期健康體檢兒童70例為對照組，其中男37例，女33例；年齡1～5歲，平均(3.86±1.17)歲。2組患兒年齡、性別比差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經本院倫理委員會批準，患兒家屬知情且簽署同意書。

1.2 納入與排除標準 納入標準：對照組兒童近期無發燒、過敏及感染等病癥；哮喘患兒未服用激素類藥物；對照組兒童未有過敏性鼻炎等過敏性疾病。排除標準：合并自身免疫性疾病患兒。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取與引物合成：分別采集2組兒童外周靜脈血2 ml，置于抗凝試管內，采用DNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)提取基因組DNA，IL-17基因rs2275913位點正向引物序列為5’-GCATAACTCTTCTGGCAGCTGTA-3’，反向引物序列為5’-TGCCCACGGTCCAGAAATA C-3’，延伸引物序列為5’-TTTTTCCCAATGAGGTCATAGAAGAATCTCT-3’，引物由上海英濰捷基生物公司設計合成。

1.3.2 采用聚合酶鏈反應-限制性內切酶片段長度(PCR-RFLP)檢測IL-17 rs2275913基因多態性:采用聚合酶鏈反應-限制性內切酶片段長度(PCR-RFLP)檢測IL-17 rs2 275 913基因多態性，PCR目的片段擴增反應體系共25 L，2×Taq PCR MasterMix(北京中科瑞泰生物科技有限公司)12.5 L，正反向引物各0.8 L，DNA樣本2 L，ddH2O 8.9 L。置于Eppendorf聚合酶鏈反應PCR儀(德國艾本德公司)進行PCR反應，程序設定：94℃ 5 min；95℃ 30 s；59℃ 40 s；72℃ 30 s，共35個循環，72℃終延伸5min。采用瓊脂糖凝膠電泳反應檢測PCR反應產物以判斷擴增結果，取PCR反應產物進行PCR-RFLP檢測，限制性內切酶XMNI購自美國Fermentas公司，配制酶切體系共15 L：5 L PCR產物，限制性內切酶XMNI 0.5 L，10×FastDigest Green Buffer(北京索萊寶科技有限公司)1 L，ddH2O 8.5 L。37℃恒溫水浴鍋內反應5 min，65℃恒溫水浴鍋內反應5 min，采用瓊脂糖凝膠電泳反應檢測酶切結果，其中BeckmanDU640型核酸蛋白分析儀購自美國Beckman公司。運用BOX凝膠成像系統(美國ThermoFisher公司)鑒定，采用ABI 3730XL測序儀(天津金思德生物技術有限公司)與GeneMapper4.0軟件(美國ThermoFisher公司)進行序列測定確定基因分型。

1.3.3 結果判定:根據電泳條帶確定IL-17 rs2275913基因多態性：野生型純合子GG型，兩條DNA條帶，246 bp、122 bp；突變雜合子GA型，三條DNA條帶，368 bp、246 bp、122 bp；突變純合子AA型，一條DNA條帶，368 bp。

1.3.4 哮喘相關性指標檢測:采集哮喘患兒外周血2 ml置于EP試管內，取1 ml血液樣本采用化學發光法檢測總免疫球蛋白E(IgE)水平，檢測試劑盒購自武漢明德生物科技股份有限公司；采用流式細胞術檢測嗜酸性粒細胞比例。1 ml血液樣本放入離心機內離心(3 000 r/min 20 min)，采用酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測人軟骨糖蛋白39(YKL-40)水平，檢測試劑盒購自合肥萊爾生物科技有限公司。分別采集哮喘患兒空腹靜脈血5 ml置于EDTA試管內，以3 000 r/min轉速離心15 min，吸取上清液于另一試管內，置于-80℃超低溫冰箱內保存，采用ELISA法檢測血清IL-17、白細胞介素-4(IL-4)水平，檢測試劑盒均購自美國RapidBio Lab公司。

2 結果

2.1 IL-17A rs2275913基因多態性檢測結果 IL-17A rs2275913位點存在單核苷酸多態性，分別為野生型純合子GG型、突變雜合子GA型、突變純合子AA型，測序驗證準確率為100%。見圖1。

2.2 Hardy-weinberg遺傳平衡驗證 對照組與哮喘組IL-17A rs2275913位點基因型頻率實際值與預測值對比，差異均無統計學意義(P>0.05)，其基因型頻率穩定，符合Hardy-weinberg平衡定律。見表1。

圖1 IL-17A rs2275913 G/A位點PCR產物酶切后電泳圖

表1 IL-17A rs2275913基因型頻率實際值與預測值比較 例(%)

2.3 2組基因型頻率比較 IL-17A rs2275913位點基因型頻率在對照組、哮喘組間分布對比，差異有統計學意義(P<0.05)，且哮喘組A等位基因頻率高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組基因型頻率對比分析 例(%)

2.4 IL-17A rs2275913基因多態性對哮喘指標水平的影響 哮喘組患兒血漿YKL-40濃度、IgE、IL-4、IL-17水平及嗜酸性粒細胞比例在IL-17A rs2275913位點不同基因型中差異均統計學意義(P<0.05)，GA、AA基因型哮喘患兒血漿YKL-40濃度、IgE、IL-4、IL-17水平及嗜酸性粒細胞比例均顯著高于GG基因型患兒(P<0.05)。見表3。

基因型IL-4(pg/L)IgE(mg/L)YKL-40濃度(ng/ml)嗜酸性粒細胞比例(%)IL-17(ng/L)GG(n=16)86.31±14.5815.53±5.3156.41±12.811.41±0.2235.21±11.25GA(n=52)95.47±15.27?18.76±4.71?65.27±16.14?1.67±0.17?45.67±10.24?AA(n=30)110.37±18.38?20.36±5.19?70.24±13.16?1.88±0.14?68.31±16.78?F值13.5224.9544.56640.45844.550P值<0.010.0090.013<0.01<0.01

注：與GG基因型比較，*P<0.05

2.5 IL-17A rs2275913基因多態性與兒童哮喘易感性的關系 以GG基因型為參照比較IL-17A rs2275913位點突變雜合基因型GA、突變純合基因型AA與兒童哮喘易感性的關系，Logistic回歸分析法矯正患兒年齡、病程、性別等多因素后，結果顯示攜帶AA基因型與攜帶A等位基因兒童患哮喘的風險分別是攜帶GG基因型兒童的2.260倍、2.085倍。見表4。

表4 IL-17A rs2275913基因多態性與兒童哮喘易感性的關系

3 討論

哮喘是由多基因調控的遺傳病，而免疫功能紊亂是其主要發病機制，研究表明個體內Th1/Th2比例偏向Th2細胞導致Th1細胞功能受到抑制從而導致兒童哮喘發生及發展[6,7]。因此，從分子生物學的角度闡明兒童哮喘的病因和病理，發現與兒童哮喘有關的致病基因有助于兒童哮喘的預防及治療。

IL-17是Th17細胞的效應因子，其可通過誘導組織發生炎癥反應進而參與哮喘等疾病的發生及發展過程[8]。IL-17可通過促進或刺激樹突狀細胞等產生炎性介質或趨化細胞因子進而引發炎性反應，同時其還可激活巨噬細胞、上皮細胞等促使其釋放白細胞介素-1(IL-1)等炎性細胞因子進而引發氣道炎癥反應及氣道重構[9]。研究表明IL-17A基因單核苷酸多態性與自身免疫性疾病等多種疾病發生密切相關，IL-17A rs2275913位點G等位基因突變為A等位基因進而影響蛋白質表達水平導致遺傳易感性[10,11]。IL-17A rs2275913基因位點A等位基因攜帶者可增加胃癌發生風險，還可增加丙型肝炎病毒感染所致肝損傷發生風險，同時還與病毒性心肌炎患者心肌損傷程度有關[12-14]。關于IL-17A rs2275913基因位點多態性與兒童哮喘的研究相對較少，本研究結果顯示哮喘組與對照組兒童IL-17A rs2275913基因位點均存在單核苷酸多態性即G→A，野生基因型為GG、雜合基因型GA、突變純合基因型AA，且2組IL-17A rs2275913基因位點各基因型頻率均符合Hardy-weinberg平衡定律，同時IL-17A rs2275913位點基因型頻率在對照組、哮喘組間分布對比差異有統計學意義，且哮喘組A等位基因頻率高于對照組，說明IL-17A rs2275913位點A等位基因頻率升高可能引發兒童哮喘。提示IL-17A rs2275913位點基因多態性與兒童易感性有關，可能為兒童哮喘易感基因。

IL-17A rs2275913位點野生型等位基因G突變為A后可增強其基因轉錄活性并激活其基因表達進而促進IL-17合成及分泌導致AA基因型攜帶者血清IL-17水平升高[15,16]。本研究分析兒童哮喘IL-17A rs2275913位點多態性可知哮喘組突變基因型GA+AA患兒比例高于對照組，而GG基因型低于對照組，由此推測IL-17A rs2275913位點G→A后IL-17A基因轉錄活性增強并提高IL-17水平進而介導氣道炎癥反應。研究表明哮喘患者血清IL-4、IL-17水平明顯身高并可促進IgE合成，而IgE含量與哮喘患者氣道高反應性高度呈正相關[17]。本研究結果顯示哮喘組患兒血清IgE、IL-4、IL-17水平及嗜酸性粒細胞比例在IL-17A rs2275913位點不同基因型中差異均具統計學意義，GA、AA基因型哮喘患兒IgE、IL-4、IL-17水平及嗜酸性粒細胞比例均高于GG基因型，說明攜帶AA基因型兒童氣道高反應性有關，提示IL-17A rs2275913位點多態性與氣道高反應性密切相關。YKL-40屬于幾丁質酶樣蛋白并可水解幾丁質聚合物，研究表明YKL-40可通過激活呼吸道上皮細胞蛋白酶活化受體2進而參與哮喘發生及發展過程[18]。本研究結果顯示GA、AA基因型哮喘患兒YKL-40濃度高于GG基因型，說明攜帶AA基因型哮喘患兒伴隨相對較高的YKL-40濃度，而攜帶GG基因型患兒與之相反。提示兒童群體中IL-17A rs2275913位點A等位基因是哮喘的易感因子，而G等位基因可能對哮喘發揮保護作用。同時本研究采用Logistic回歸分析法分析IL-17A rs2275913基因多態性與兒童哮喘易感性的關系，結果顯示攜帶AA基因型與攜帶A等位基因兒童患哮喘易感風險分別是攜帶GG基因型兒童的2.260倍、2.085倍，提示攜帶AA基因型的兒童極易產生哮喘易感性。

綜上所述，IL-17A基因rs2275913位點多態性與兒童易感性有關，AA基因型攜帶者極易發生哮喘，可能作為防治兒童哮喘的候選基因進而為兒童哮喘早期預防及個體化治療提供依據。然而，不同地區兒童基因多態性分布頻率不同導致患兒易感性不同，因而仍需擴大樣本量對不同地區兒童進行研究，以期揭示IL-17A基因rs2275913位點多態性與兒童哮喘易感性的內在作用機制。