骨 肉 瘤 免 疫 療 法 的 研 究 進 展

黃 重 賈瑞鵬 鐘海琳 符策崗

(1 中南大學湘雅醫學院附屬海口醫院骨科中心，海南省海口市 570208，電子郵箱：840351452@qq.com；2 上海市第六人民醫院暨海南省海口骨科與糖尿病醫院骨科，海口市 570000)

【提要】 骨肉瘤發病率在兒童和青少年惡性腫瘤中居首位，肺部轉移率高，僅行手術治療的患者存活率較低。免疫療法具有腫瘤免疫殺傷特異性，被認為是最有可能提高癌癥患者生存率的治療方法之一，可作為骨肉瘤新的治療方向。本文就骨惡性腫瘤的生物學特點、骨肉瘤肺部轉移的機制以及免疫療法的機制進行綜述。

骨肉瘤好發于15～25歲的青少年，以男性患者居多，其發病率在兒童和青少年惡性腫瘤中居首位。骨肉瘤好發于長骨干骺端、股骨遠端和脛骨近端，具有很強的侵蝕性，肺部轉移率高達20%～25%，由于缺乏高效的藥物治療，骨肉瘤一旦復發或轉移，5年存活率僅為20%[1-2]。

近年來，腫瘤免疫療法受到人們的廣泛關注，且被認為是最有可能提高癌癥患者生存率的治療方法之一。研究發現，骨肉瘤局部CD8+侵蝕性淋巴細胞的比例明顯高于其他肉瘤亞型，且浸潤程度與生存率呈正相關[3]。骨肉瘤基因高度不穩定，其瘤細胞表面常表達程序性細胞死亡蛋白1配體(programmed cell death ligand 1,PD-L1)，這提示程序性細胞死亡蛋白1(programmed cell death protein 1,PD-1)/PD-L1軸的抑制劑具有潛在的治療價值[4]。此外，多種癌癥相關細胞表面蛋白可以作為抗體靶向用于腫瘤免疫治療，其中米法莫肽是目前的研究熱點之一[5]。米法莫肽是一種細菌細胞壁的類似物，可以通過活化單核細胞和巨噬細胞來刺激腫瘤免疫殺傷，從而抑制腫瘤的發展。目前，歐洲已經批準米法莫肽用于治療骨肉瘤，其臨床隨機Ⅲ期實驗已證實，在常規化療的基礎上增加米法莫肽能有效提高骨肉瘤患者的生存率[5]。因此，了解骨肉瘤的發生發展過程以及免疫治療的新進展，對提高患者的存活率至關重要。本文就骨惡性腫瘤的生物學特點、骨肉瘤肺部轉移的內在機制以及骨肉瘤免疫療法的機制進行綜述，為骨肉瘤的治療提供新思路。

1 骨惡性腫瘤的生物學特點

骨惡性腫瘤的發生和發展主要受致癌因素和癌細胞與周圍微環境之間的相互作用的影響。普遍認為，骨惡性腫瘤的主要來源為間充質干細胞(mesenchymal stem cell,MSC)，MSC在分化期間可能發生基因突變(P53、Rb等)，這增加了MSC轉化為癌細胞的風險，最終導致惡性成骨細胞或惡性軟骨細胞的出現。與其他非惡性同類腫瘤相比，骨肉瘤細胞和軟骨肉瘤細胞能特異性表達Runx2和Sox9[6]，甚至可以通過這種主基因的表達明確MSC癌變過程中的傾向性[7]。因此，骨肉瘤細胞可不同程度表現出成骨細胞分化過程中的特性，例如骨肉瘤細胞可以表達成骨細胞標記物(堿性磷酸酶、骨鈣蛋白或骨涎蛋白)，也可以表現出促進類骨質組織形成和活化細胞外基質的能力。此外，軟骨肉瘤細胞還具有軟骨細胞的特征，可以表達軟骨細胞標記物(如Ⅱ型膠原蛋白或聚集蛋白聚糖)，也可以產生軟骨基質，將惡性軟骨細胞包裹在其中[7]。目前普遍認為，骨肉瘤和軟骨肉瘤形成的原因是由MSC分化受損所致，但尤文肉瘤的起源仍頗受爭議。實際上，尤文肉瘤細胞可特異性表達融合蛋白，該蛋白是由2號染色體上的尤文肉瘤基因和表達序列標簽家族基因之間染色體發生易位而產生[8]。然而，由于尤文肉瘤在骨中的發病位置復雜，且尤文肉瘤FLI1基因在尤文肉瘤細胞中沉默，導致尤文肉瘤的起源難以確定[8]。目前，關于尤文肉瘤的起源存在3種假設，即神經嵴干細胞[9]、胚胎骨軟骨祖細胞[10]和MSC[11]。已有學者對骨惡性腫瘤的發病機理等進行研究，但仍未完全闡明[12]。

2 骨肉瘤肺轉移的內在機制

僅進行手術治療的骨肉瘤患者5年存活率不足20%，采用手術與化療聯合治療后5年存活率可提高至70%，但一旦發生轉移(肺部轉移常見)，患者5年生存率又降低至20%[13]。因此，了解骨肉瘤從骨骼部位(原發病灶)擴散到肺組織的內在機制，有助于預防骨肉瘤轉移或特異性殺傷轉移性病變，提高療效，改善預后[14]。目前已明確部分涉及骨肉瘤轉移的分子機制。研究顯示，WNT/β-連環蛋白途徑在骨肉瘤原發灶中被激活并促進癌細胞的早期轉移，包括促進骨肉瘤細胞侵襲、趨化和外滲[15]，阻斷該途徑對抑制骨肉瘤的轉移具有重要的意義[16-17]。還有研究顯示，Notch信號途徑可促進骨肉瘤的轉移，γ-分泌酶抑制劑可以阻止這一類轉移的發生和發展[18]。此外，骨肉瘤細胞高度表達埃茲蛋白，埃茲蛋白可以將肌動蛋白細胞骨架與細胞外基質連接起來，并作為磷脂酰基醇3-激酶/蛋白激酶信號傳導的支架，促進骨肉瘤的轉移；埃茲蛋白的抑制劑具有阻斷骨肉瘤細胞侵襲并抑制轉移的作用[19]。原發病灶微環境中的一些細胞因子(間質源性轉化生長因子β和白細胞介素6)可以通過細胞核因子κB活化因子/細胞核因子κB受體活化因子信號通路活化細胞核因子κB，發揮促進骨肉瘤發生和發展的作用[20]。由腫瘤細胞分泌的ΔNp63衍生物白細胞介素6和白細胞介素8可促進骨肉瘤轉移并定植于肺部[17]，靶向阻斷該途徑能有效防止骨肉瘤轉移[21]，目前此途徑的臨床試劑已經進入臨床階段。此外，許多肺部特異性代謝過程在骨肉瘤定植中發揮重要作用，包括轉移相關gp78的上調[22]、蛋白激酶C激活[23]或mTOR途徑激活[24]等。因此，闡明骨肉瘤肺轉移過程的內在機制，對骨肉瘤的治療和預防具有重要意義，但相關研究進展緩慢，且需要投入較大的人力和物力，目前可能還存在很多重要的途徑仍未發現，進一步研究已發現的機制和療法，或可為發現更有效的骨肉瘤治療方式，提高患者的生存率提供幫助。

3 腫瘤免疫療法

人類免疫系統是機體內一種高度復雜的防御系統，由多種細胞參與并共同作用以抗擊外來的威脅(例如感染、腫瘤)，同時保持自身免疫穩定。傳統化療的靶向是惡性增殖細胞，但免疫療法能準確靶向到癌細胞本身，因此，與化療相比，免疫治療的針對性更強。免疫系統與癌癥之間的相互作用較復雜，包括免疫監視、免疫細胞浸潤和腫瘤細胞溶解，但是腫瘤細胞可以通過釋放抑制性細胞因子和下調細胞表面標志物的表達來抑制免疫反應，目前將這種現象稱為癌癥“免疫編輯”，由消除、平衡和逃避3個不同階段組成[25]。消除主要涉及發現癌癥特異性抗原、形成腫瘤特異性T細胞、破壞腫瘤細胞等過程。但一些癌細胞可以在消除階段存活并進入平衡階段，進入平衡階段的癌細胞有可能適應免疫系統長期的腫瘤特異性應答，并保持休眠狀態，最后可能發生進化并實現免疫逃逸，從而增殖[25]。腫瘤細胞免疫逃逸的機制包括腫瘤抗原表達缺失、來自癌細胞表面的人白細胞抗原下調、調節性T細胞或腫瘤相關的M2巨噬細胞募集等，這些機制都具備免疫抑制作用，可上調T細胞上抑制性受體(如細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白4、PD-1)或腫瘤細胞上抑制性配體(如PD-L1)的表達，從而抑制免疫反應[26]。免疫療法旨在抵消這些逃逸現象，增強患者的免疫功能，從而識別和破壞癌細胞，其相關機制主要涉及以下幾種物質。

3.1 針對細胞表面蛋白的抗體 骨肉瘤細胞表面存在多種抗原，這些抗原可以作為腫瘤免疫治療的靶向。已有研究證實，腫瘤免疫治療可有效治療神經母細胞瘤，這給針對癌細胞表面蛋白的抗體靶向治療帶來了希望[25]。其原理是將單克隆抗體與腫瘤細胞表面抗原結合，并激活自然殺傷細胞和巨噬細胞釋放細胞毒性物質，從而針對性地殺傷腫瘤細胞，這個過程也被稱為抗體依賴性細胞毒作用。此外，雙特異性T細胞鏈接器是一種含有兩個單鏈可變區基因片段的抗體，可以通過柔性接頭將T細胞上的CD3受體與腫瘤抗原緊密連接，導致T細胞活化并殺傷癌細胞[27-28]。將抗體與細胞毒性劑(如維多汀)鏈接在一起，也可用于癌細胞的特異性化療[29]。

3.2 腫瘤疫苗和樹突狀細胞 腫瘤疫苗包括腫瘤細胞本身、溶解產物、蛋白質、DNA、RNA和肽類等。腫瘤疫苗是癌癥免疫療法的早期方式之一，其原理是通過暴露(接種)腫瘤抗原誘導腫瘤特異性免疫反應。樹突狀細胞是抗原呈遞細胞，具有活化T細胞并引起細胞毒性T淋巴細胞增殖的能力[30]。癌癥患者體內成熟的樹突狀細胞往往含有特異性顆粒(如腫瘤細胞裂解物)，將其離體后添加免疫佐劑然后重新注射到患者體內，可有效增強腫瘤的免疫殺傷作用[31]。

3.3 溶瘤病毒 溶瘤病毒是由基因工程制造的一種弱化病毒，其特點是僅在惡性細胞中復制。由于溶瘤病毒不依賴于特定的腫瘤細胞抗原，因此非常適用于實體腫瘤的治療，其除了能特異性發揮腫瘤細胞的毒性作用外，還可促進腫瘤微環境的炎癥反應，進一步促進抗原呈遞和抗原呈遞細胞成熟，增強了腫瘤殺傷作用[32]。

3.4 過繼性細胞療法 過繼性細胞療法是通過細胞溶解細胞刺激機體發生抗腫瘤反應的一種免疫療法[30]，旨在抵消腫瘤細胞的各種免疫逃逸。例如，惡性腫瘤細胞可以通過下調人白細胞抗原和其他腫瘤特異性抗原，使其不被T細胞識別。為了解決這個問題，可以對T細胞進行設計，增強其對特定抗原的親和力，而不需要通過人白細胞抗原的呈遞也可以進行肽識別。這些經過基因工程改造的T細胞被稱為嵌合抗原受體T細胞，它由細胞外結構域(包含針對腫瘤表面特異性抗原的單克隆抗體)、間隔結構域、跨膜結構域和細胞內信號轉導鏈共同組成[33]。研究發現，采用CD3和CD28抗體與重組白細胞介素2活化骨肉瘤患者外周血中的單核細胞，然后用編碼靶抗原的逆轉錄病毒顆粒(如人類表皮生長因子受體2)進行轉導，再用白細胞介素2進一步擴增T細胞系，測試其免疫特異性后再回輸給患者，可增強骨肉瘤的免疫殺傷能力[27]。

過繼性細胞治療也可以選用自然殺傷細胞和腫瘤浸潤淋巴細胞(tumor infiltrating lymphocyte,TIL)。自然殺傷細胞是先天免疫系統中的淋巴細胞，具有細胞毒性和調節功能。與T細胞和B細胞不同，自然殺傷細胞可以在沒有免疫暴露的情況下事先識別目標。TIL是過繼性細胞療法的另一種形式，在腫瘤抗原的幫助下TIL可以高度特異性地遷移到腫瘤中，并直接殺死腫瘤細胞，同時釋放細胞因子，進一步介導抗腫瘤反應[34]。

3.5 檢查點抑制劑 由于惡性腫瘤細胞可以通過抑制檢查點配體的免疫反應而逃避免疫監視，在沒有經過離體擴增的情況下，內源性TIL通常無法完全抑制腫瘤的生長[35]。檢查點抑制劑可以重新激活T細胞介導的腫瘤抗原特異性反應，并逆轉這一現象，其機制是通過組織相容性復合物激活機體對新抗原的反應[28]。雖然目前尚不能證實骨肉瘤復雜的基因組和染色體的不穩定性是否會引起基因突變，但是其高度的遺傳不穩定性很可能產生新的免疫介導殺傷基質表位，從而增強檢查點抑制劑(如細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白4、PD-1和PD-L1的抑制劑)用于腫瘤治療的潛力[36-37]。

細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白4是在調節性T細胞和記憶T細胞上表達的跨膜糖蛋白受體，在與樹突狀細胞上的CD80/86鏈接后可以抑制免疫功能[36]。與健康人相比，骨肉瘤患者的細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白4表達增加，因此人們提出，細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白4抑制劑可以用于骨肉瘤的治療[38]。PD-1是在T細胞上表達的另一種跨膜免疫球蛋白家族成員，其在慢性活化的T細胞中表達最高[39]，PD-1是免疫系統的“剎車”，可以抑制細胞毒性T淋巴細胞并激活Treg細胞，且重要的是，其配體(PD-L1)在骨肉瘤腫瘤細胞和免疫細胞表面均有表達[37]。

4 小 結

免疫療法為骨肉瘤的治療帶來了新的曙光，目前已有學者致力于研究各種免疫療法應用于腫瘤治療的效果和新藥物的研發。然而，由于免疫系統的復雜性和腫瘤特異性微環境的細微差別，且腫瘤本身也會通過多種途徑抵抗免疫療法，使得免疫療法在骨肉瘤中的應用研究進展緩慢。進一步闡明現有免疫療法的抵抗機制，開發和測試合理的聯合療法(手術+化療+抗轉移/復發+免疫療法)對提高骨肉瘤的治療效果和患者的生存率至關重要，免疫療法有望成為骨肉瘤治療的新突破。