醛固酮對(duì)豚鼠耳蝸ENaC調(diào)控作用與NF-κB活性相關(guān)

黃巧 廖行偉 翟思佳 劉宇超 尹時(shí)華

廣西醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科

梅尼埃病的基本病理表現(xiàn)為膜迷路積水，近年來醛固酮腹腔注射廣泛用于膜迷路積水造模。NF-κB由Rel蛋白家族的同二聚體或異二聚體組成，p50/p65異二聚體是經(jīng)典且最常見的形式[1]。越來越多研究表明醛固酮顯著增加NF-κB的磷酸化[2,3]，在皮質(zhì)集合管主要細(xì)胞中研究表明醛固酮激活了NF-κB通路，進(jìn)而影響αENaC mRNA的表達(dá)水平[4]。在豚鼠耳蝸中研究發(fā)現(xiàn)，醛固酮早期能增強(qiáng)αENaC的表達(dá)[5]，而在耳蝸中是否也存在醛固酮通過激活NF-κB信號(hào)通路，從而調(diào)控αENaC的表達(dá)呢？PDTC為NF-κB活化拮抗劑，王朝永[6]通過研究發(fā)現(xiàn)腹腔注射PDTC能在一定程度上減輕內(nèi)毒素誘發(fā)的迷路炎和聽力損害。因此，為了進(jìn)一步探索在耳蝸中NF-κB是否也有助于醛固酮刺激的αENaC表達(dá)，本實(shí)驗(yàn)通過腹腔注射PDTC拮抗NF-κB活化，并采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time PCR,qRT-PCR）和免疫組織化學(xué)染色分別檢測(cè)各組豚鼠耳蝸組織中αENaC mRNA和蛋白表達(dá)水平。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)主要試劑

醛固酮購于sigma公司，TRIZOL(Life Technology公司，美國)，逆轉(zhuǎn)錄盒與熒光定量PCR試劑盒均購于天根生化科技有限公司，αENaC抗體（GTX110436，GeneTex，美國），引物利用Primer Premier設(shè)計(jì)，通過BLAST分析，挑選最佳序列由上海生工生物工程股份有限公司合成，αENaC引物序列為 F:5′TCTGCGACTACACGAACCAC3′；R:5′ CTGAAGGCCAGCGTGAGTAA3′，產(chǎn)物長度156bp。選取β-actin作為內(nèi)參對(duì)照，β-actin引物序列為F:5′CGCGCAGAAAACGAGATGAG3′；R:5′TGTCACCTTCACCGTTCCAG3′產(chǎn)物長度113bp。免疫組化試劑盒購于北京中杉金橋生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物處理

選擇耳廓反應(yīng)靈敏、電耳鏡檢查雙側(cè)鼓膜完整、且未暴露于噪聲環(huán)境及耳毒性藥物使用史的健康花色豚鼠42只，雌雄不限，體重250-300g，由廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。……