多肽類藥物防治缺血性腦卒中的研究進展

梁旭玲，鄧莉，梁泉燕，朱艷

(廣東醫科大學寄生蟲教研室，廣東 湛江 524023)

0 引言

腦卒中是一組由于腦血管阻塞或爆裂而導致的腦血流中斷所引起的腦損傷、身體殘疾或多重功能損傷的臨床綜合癥。缺血性腦卒中(ischemic stroke，IS)是臨床上最常見的一種中風類型，其占卒中總數的60%～70%，具有高發病率、高致殘率、高死亡率和高復發率的特點[1-2]。腦卒中已成為人類第二大致死致殘率高的疾病和我國最主要的死亡原因之一，嚴重影響著人們的健康[3]。流行病學研究顯示過去20年中，西方國家的中風發病率下降了42%，而我國同期卻有增加的趨勢[4-5]。盡早恢復缺血腦組織血液供應或再通仍然是臨床上IS的首要治療原則，但腦血管血流再通同時，可引起缺血腦組織進一步損害，臨床癥狀進一步惡化，即引起缺血再灌注損傷(ischemia-reperfusion injury，I/R)。作為目前唯一被批準用于急性IS溶栓治療的臨床一線藥物組織纖溶酶原激活物(tissue plasminogen activator，tPA)，由于只有3～4.5 h的狹窄治療時間窗以及顱內出血風險評估，故只有3%～4%的中風患者可以接受其治療。然而，IS是一個復雜的病理生理過程，其發病機制尚沒有得到完全闡明，目前認為是氧化損傷、炎癥、凋亡、自噬等多種復雜機制所導致的[6]，然而各種發病機制之間常常相互影響，共同主導IS的發生發展。

多肽藥物是一類介于大分子蛋白/抗體類藥物和小分子化學藥物之間的藥物類別，主要由10～50個氨基酸所組成。因其生物活性高、靶向專一性高、選擇性高、毒副作用低等優點而被廣泛應用于多種疾病的治療[7]。近年來基因組學、蛋白組學等生物信息學研究方法興起以及組合化學、高流通量篩查等多肽藥物篩選方法的應用，越來越多的多肽類藥物逐漸應用于多種疾病的診斷和防治。此外，微球、脂質體等藥劑學新方法的應用大大提高了多肽類藥物的成藥性，如提高穩定性、延長體內半衰期等，促進了多肽類藥物的新藥開發[8-9]。多項臨床前實驗和臨床研究表明，多肽類藥物藥效廣泛，可用于防治IS、血栓性疾病、骨質疏松癥等多種疾病[10-11]。目前，美國、歐盟等西方國家已批準了上百種多肽類藥物上市[12]，并已顯示出巨大的經濟和社會效益[13]。除了tPA、尿激酶等幾種蛋白溶栓藥外，目前還沒見防治IS的多肽類藥物應用于臨床，但臨床前研究已發現較多的多肽類藥物對IS的防治顯示出理想的效果，且作用機制不限于溶栓。

1 IS的病理過程

按血流情況，IS的病理過程可分為2個階段，分別為缺血期和再灌注期。第一階段：由于大腦血管堵塞導致腦組織供血不足，能量代謝出現障礙，神經元細胞逐漸壞死，梗死灶開始形成，此時腦組織處于“零血流”的病理狀態，即為缺血期[14]；第二階段：缺血腦組織恢復部分血供，但血腦屏障(blood brain barrier，BBB)的通透性增加，自由基大量產生，氧化應激和炎癥反應進一步加重。同時白細胞大量聚集并黏附于受損的毛細血管內皮上，堵塞微血管，血流無法通過，出現“零復流”現象，即為再灌注期[15]。“零血流”和“零復流”現象已成為IS的主要病理特點，同時是IS藥物治療面臨的最大瓶頸。值得注意的是正常腦組織區域與梗死區域之間存在半暗帶，半暗帶是指具有潛在性或可逆性的腦缺血梗死灶的周邊區域，即在治療時間窗內恢復該區域的血供，腦組織還可恢復正常[16]。

按時間進程，IS的病理過程又可分為急性期，亞急性期和慢性期3個階段。在急性期(數分鐘至數小時)，缺血腦組織迅速產生大量促炎細胞因子、活性氧自由基(reactive oxide species，ROS)、趨化因子等，進一步激活并誘導內皮黏附分子的大量表達，從而促進血液中白細胞進入腦實質；在亞急性期(數小時至數天)，進入腦實質的白細胞釋放大量趨化因子、細胞因子基質金屬蛋白酶、ROS等炎癥介質，加重腦部炎癥反應和氧化損傷，最終導致BBB破損、腦水腫、神經細胞凋亡等病理變化，需要注意到的是有研究認為缺血后炎癥反應可能參與了慢性期的功能恢復[17]；慢性期是指IS發生后的1～6個月期間[18]，卒中慢性期的幸存者中最常見的長期后遺癥為血管性認知障礙、卒中后抑郁、運動障礙。有研究認為長期后遺癥是由神經抑制因子、免疫激活、神經毒性等因素所導致[19]。

綜上可知，IS是一個十分復雜的病理生理過程，梗塞后的腦組織損傷更是由多種復雜機制共同導致的。如血栓脫落所導致的腦缺血，因血流供應不足和能量代謝障礙，缺血區域神經元發生不可逆性壞死。在缺血半暗帶中，能量代謝障礙可引起體內離子穩態失衡，導致大量的Ca2+內流，引起鈣超載，進而誘導谷氨酸的過量釋放，引起興奮性氨基酸毒性的發生。過量釋放的谷氨酸可與神經細胞谷氨酸受體結合引發線粒體鈣超載及功能障礙，最終導致神經細胞的凋亡，同時Ca2+大量內流帶動水分子被動內流，誘發神經細胞水腫；此外，激活的小膠質細胞釋放大量的促炎細胞因子，誘導白細胞的浸潤，從而誘發神經性炎癥。炎癥細胞同時產生過量ROS 和活性氮(reactive nitrogen species，RNS)，其反過來誘導炎癥細胞，形成惡性循環。此外，隨著血流和供氧的恢復，ROS和RNS可大量生成，加重損傷BBB，最終導致不可逆的腦組織損傷。

2 多肽類藥物及作用機制

2.1 氧化損傷與多肽類藥物

氧化損傷(oxidative damage，OD)是體內氧化還原狀態失衡，即腦組織的抗氧化能力小于缺血所引起的一系列促氧化效應，從而引起的腦損傷。然而OD是機體長期積累的結果，特別是兼有高血壓、糖尿病等疾病的IS患者，OD更加明顯，更易發生IS[20]。此外，ROS在體內可作為信號分子引發炎癥、凋亡等事件發生。正常人群腦組織中含有大量的不飽和脂肪酸，其中以亞油酸居多，不飽和脂肪酸容易被氧化，當機體出現氧化應激反應時，不飽和脂肪酸的氧化產物可對腦組織產生損傷，致使線粒體的三羧酸循環發生障礙，合成ATP的能力下降。當IS患者經過初步的溶栓治療后，完成血液再次貫通，可引起進一步的氧化損傷，即缺血再灌注損傷。此時氧氣分子轉化成負離子狀態，部分在分解酶的作用下形成氫氧根離子，形成大量的ROS。過量的ROS可攻擊DNA、蛋白質和磷脂雙鍵等重要的細胞組分，引起基因突變、蛋白變性、膜損傷等一系列事件發生，此外，還可誘發炎癥和凋亡的重要信號啟動，最終導致細胞凋亡和壞死。同時ROS 誘使血管內皮細胞、神經膠質細胞和神經細胞釋放基質金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinases-9，MMP-9)，進一步損傷BBB，從而改變腦組織神經細胞的生理環境，加重神經炎癥反應和腦水腫。BBB的損傷可間接引起鈣超載，進一步加重腦組織損傷[21]。此外，體內激活的中性粒細胞可合成并釋放大量的ROS，參與腦缺血再灌注損傷過程[22]。

熱休克蛋白(heat shock protein，Hsp)是Ritossa最先在果蠅唾液腺中發現具有遺傳高度保守的熱應激蛋白質，又稱應激蛋白。其分布廣泛，存在于多種生物細胞當中。有研究表明當遭受缺血、氧化應激等應激時，Hsp在蛋白質內穩態、凋亡、細胞信號轉導中均扮演著極其重要的角色[23]。基于氨基酸序列和分子量大小，Hsp可分為5個家族：(1)高分子量100～110 kD家族；(2)83～90 kD家族；(3)Hsp70家族：66～78 kD；(4)Hsp60家族；(5)sHsp家族：15～30 kD。Hsp27屬于sHsp家族的重要一員，分子量約為27 kD。其C末端包含一個高度保守的α晶體蛋白結構域，而N末端包含保守程度較弱WDPF結構域。正常生理狀態下，其在細胞的分化和發育中扮演著重要的角色；當受到外界不良刺激時，誘使Hsp27大量表達，可保護細胞免受外界不良刺激的損害。已有研究證據表明，在多種神經疾病模型中，Hsp27可明顯減少神經細胞的損傷，在神經保護中起著重要的作用。Hsp27模擬肽(HSP27MP)是一種結構和功能與Hsp27類似的人工合成多肽。其氨基酸序列(專利原因暫未公開)可與凋亡信號調節激酶 I(ASK1)有效物理結合，抑制下游通路。吳慶建等[24]研究表明，HSP27MP可顯著升高超氧化物歧化酶、谷胱甘肽和過氧化氫酶的活性，抑制ROS的產生，進而改善缺血性腦梗死損傷。脂聯素(adiponectin，APN)是脂肪細胞分泌的一種內源性生物活性糖蛋白。其由244個氨基酸所組成，單聚體分子量為30 kD。在結構上，APN由22個膠原重復序列的柄和高度保守的球狀結構域所組成。正常機體的血漿中APN含量豐富，具有多種生物學功能，如具有降血脂、降血糖、胰島素增敏等作用。有相關研究[25]證實，APN通過抑制氧化應激損傷，從而發揮相應的保護作用，而同時亦有研究[26]證明，機體脂聯素的分泌不足與腦缺血損傷的嚴重程度成正比。脂聯素多肽是根據脂聯素氨基酸序列，采用蛋白質分析技術和多肽合成技術得到的一種多肽，岳亮等[27]研究表明脂聯素多肽通過激活 SIRT1/PGC-1α通路抑制谷氨酸鹽誘導氧化應激損傷以及減輕神經細胞的凋亡。

2.2 炎癥與多肽類藥物

炎癥在IS的病程進展中發揮著重要的作用。腦缺血可引起促炎和抗炎反應之間的失衡，即促炎反應大于抗炎反應，從而引發腦組織的一系列的炎癥反應。然而，炎癥標志物的水平與IS患者的預后密切相關。IS的炎癥反應是一個動態過程，缺血損傷的初始炎癥應答常由小膠質細胞和白細胞所誘導。隨著病程的進展，缺血中心區的壞死組織釋放大量的炎癥介質，進一步激活免疫應答，從而促進更多炎癥介質的釋放，如TNF-α、IL-1β、IL-8等，加重整個炎癥進程。然而，適度的炎癥反應可維持機體內環境的穩定。在正常情況下，當機體遭受缺血、炎癥和神經變性的不良情況時，小膠質細胞下發揮其免疫巨噬細胞樣的“清道夫”功能，清除受損組織以及ROS、RNS等，維持炎癥動態平衡以及腦內微環境穩定[28]。隨著缺血進展繼續發展，一般在腦缺血后的幾分鐘內，迅速激活的小膠質細胞轉化為吞噬細胞，并且釋放多種炎癥介質[29]，增加BBB的通透性，誘使腦水腫和組織壞死的發生[30]。同時，缺血區域的星形膠質細胞也被激活并釋放ROS和炎癥介質，誘導腦內皮上黏附分子的表達并促進中性粒細胞的腦內遷移，從而激活炎癥反應。中性粒細胞一般在腦缺血損傷30 min至數小時內進入腦實質，24～48 h浸潤達到高峰[31]。中性粒細胞通過釋放大量的促炎介質，導致神經性炎癥以及神經損傷。由上可見，炎癥的發病機制涉及多方面，多層次，相當復雜，其具體機制目前尚并未完全闡明。

c-rel是核因子κB(nuclear transcription factor-κB，NF-κB)家族重要成員之一，大鼠腦缺血再灌注可上調c-rel蛋白表達，其過度活化會加重免疫炎癥反應程度。而IκappaB激酶(IκappaB kinase，IKK) -NEMO綁定區域(NEMO binding domain，NBD) 多肽是一種滲透性較強的NF-κB特異性抑制劑，它可阻止IKK降解IκappaB(IκB)，從而抑制NF-κB入核。Desai等[32]研究發現側腦室注射IKK-NBD多肽可明顯降低炎癥反應對BBB的損傷，對大鼠局灶性腦缺血具有較好的神經保護作用，其作用機制與減輕缺血后炎癥反應和減少DNA內的基因斷裂有關。此外，李揚等[33]研究證實IKK-NBD多肽可以減輕局灶腦缺血再灌注后的炎癥損傷，其作用機制與上調IκBα 限制c-rel入核，下調IL-1β，上調IL-10有關。NBD多肽是一種由6個氨基酸殘基組成并可特異性抑制NF-κB的小分子肽，其與IKK的調節亞基 NEMO 結合從而阻礙NEMO與IKK 復合物催化亞基(IKKa/IKKβ)的 NBD位點結合，影響IKK復合物之間的相互作用，阻止 IKK激活，從而選擇性地抑制NF-κB的過度激活，有效調節由 NF-κB所誘導的炎癥免疫反應[34]。秦文熠等[35]研究表明NBD多肽可有效降低促炎因子水平，減輕神經細胞受損，抑制海馬區內炎癥反應，有效緩解腦缺血再灌注損傷。

2.3 細胞凋亡與多肽類藥物

在IS的病程進展過程中，其中一個關鍵環節是細胞凋亡。降低缺血早期的細胞凋亡對改善輕度的缺血性腦損傷具有重要的意義。在缺血數小時后，細胞凋亡可見于半暗帶區。而神經細胞的凋亡主要是由B淋巴細胞瘤-2(Bcl-2)家族基因和半胱氨酸蛋白酶(Caspase)家族基因參與并以線粒體為中心的凋亡過程。作為Bcl-2家族的Bcl-2和Bax是細胞凋亡的兩個經典標志物。其中Bcl-2具有抑制凋亡的作用，而Bax具有促進凋亡的作用，兩者在細胞凋亡進程中發揮著重要的調節作用[36]。腦組織缺血損傷可降低Bcl-2的表達，增加Bax的表達，進一步激活半胱天冬酶，引發依賴性細胞凋亡的級聯反應。Caspase家族參與了線粒體依賴性途徑和非依賴性途徑。活化的半胱天冬酶，如Caspase-1 和Caspase-3主要在缺血介導的細胞凋亡早期起著關鍵作用，而其他半胱氨酸蛋白酶家族成員，如Caspase-2和Caspase-8，則可能在凋亡晚期起著重要作用。此外，在缺血性腦損傷期間興奮性毒性、鈣超載、氧化損傷、炎癥均會導致細胞凋亡，這些發病機制并非獨立存在，而是互相影響，互相促進。

扇貝多肽是利用現代海洋生物工程技術從櫛孔扇貝中提取的水溶性小分子多肽，氨基酸序列為Pro-Asn-Thr-Hyl-Ser-Cys-Arg-Cly，相對分子質量為879，現代物理學研究[37]表明其具有抗細胞凋亡、增強機體免疫功能、抗氧化等多種藥理作用。吳青等[38]研究發現扇貝多肽可顯著增強缺血海馬神經元的活性，降低凋亡率。Humanin(HN)是由Hashimoto于2001年在阿爾茨海默病(Alzheimer’S disease，AD)患者大腦枕葉皮層未受損腦區發現的一段新基因，可編碼由24個氨基酸組成的多肽，簡稱HN多肽，氨基酸序列為Met-Ala-Pro-Arg-Gly-Phe-Ser-Cys-Leu-Leu-Leu-Leu-Thr-Ser-Glu-Ile-Asp-Leu-Pro-Val-Lys-Arg-Arg-Ala。高廣生等[39]研究發現HN多肽通過激活STAT3上調抗凋亡MCL-1的轉錄，增加SOCS3的表達，降低凋亡標志性蛋白Bax、Caspase-3的表達，從而減少神經細胞凋亡。

2.4 自噬與多肽類藥物

自噬(autophagy)是細胞在溶酶體介導下通過降解細胞質中受損的生物大分子、細胞器或病原微生物，以維持細胞穩態的正常降解途徑，其具有高度保守性[40]。自噬具有多種生理和病理作用，生理狀態下，神經系統中適度的自噬反應被認為具有神經保護作用。如在缺血、缺氧等外界條件刺激下，自噬可通過降解細胞內受損的細胞器及異常生物大分子為細胞提供能量。自噬過程中，細胞質中待降解成分包被進去雙膜囊泡而形成自噬體，并與溶酶體融合形成單膜的自噬溶酶體，最后包被物被溶酶體水解酶所降解[41]。其中beclin-1和LC3是自噬反應中的兩種標志性蛋白，Bcl-2/beclin-1復合物被認為是調節自噬體膜形成的分子開關[42]，而LC3的胞漿型LC3( LC3-Ⅰ)和膜型LC3( LC3-Ⅱ)的轉化率可反映自噬水平的高低。然而，過度自噬是一種病態的生理過程，可降解細胞核導致細胞的死亡[43]。近年來研究[44]表明自噬在IS的發病機制中占著重要的地位。

細胞穿透肽(cell-penetrating peptides，CPPs)是一類對細胞膜具有強力穿透作用的短肽，某些CPPs甚至可以穿透BBB發揮其藥理作用，已有研究表明其對多種神經退行性疾病具有神經保護作用[45]。CPPs主要由5～30個氨基酸所組成，其細胞毒性較低，對機體不產生免疫反應。R18屬于CPPs的一種多肽，研究發現R18多肽可通過抑制細胞自噬保護大鼠顱腦創傷所引起的神經細胞損傷以及谷氨酸誘導的神經細胞損傷[46]，也可促進神經元的細胞活性以及抑制自噬所引起神經元損傷[47]。

3 展望

多肽類藥物作為生物醫藥中的重要一員，以其生物活性高、靶向專一性高、選擇性高、毒副作用低等優越的藥用特點，具有廣闊的臨床應用前景。一系列的多肽已對IS的防治展現出理想的效果，如HSP27MP、IKK-NBD多肽、HN多肽等，它們具體作用機制涉及氧化損傷、炎癥、凋亡和自噬等。相信隨著IS機制的深入認識以及各類多肽類藥物的不斷開發，高效、安全的抗IS多肽類藥物在未來將會廣泛用于臨床并造福患者。