低深度拷貝數變異測序在胎兒先天性心臟病中的應用研究

黃杏玲 王遠流 鄧新娥 陳惠 劉百靈 梅燕

(柳州市婦幼保健院圍產保健科，廣西 柳州 545001)

胎兒先天性心臟病(congenital heart disease,CHD)是最常見的出生缺陷，遺傳綜合型的CHD同時還伴有神經發育障礙、生長發育障礙等表現，手術后仍不能獲得正常的生活質量[1-3]。基于NGS 技術的基因組拷貝數變異測序(copy number variation sequencing，CNV-seq)為產前診斷提供了新的手段，為胎兒CHD遺傳病因的發現提供新的技術。本研究旨在評價CNV-seq分析技術在產前診斷CHD 致病基因中的臨床應用價值，探索CHD與染色體亞顯微異常的關系，為CHD的早期診斷、治療和遺傳阻斷提供依據。報告如下。

1 資料與方法

1.1研究對象 2017年1月至2019年5月在柳州市婦幼保健院進行超聲頸項透明層的檢查和/或系統彩超或針對胎兒超聲心動圖檢查等，被產前超聲診斷為胎兒心臟異常伴或不伴心外異常的孕婦。本研究已通過醫院倫理審查委員會的審查。納入標準：(1)經兩名具有產前超聲診斷資質的醫師診斷胎兒心臟結構異常伴或不伴心外異常的孕婦(2)經產前遺傳咨詢并知情同意行介入性產前診斷。排除標準：(1)有介入性產前診斷禁忌或拒絕產前診斷的孕婦(2)心臟表型只涉及心律失常或心包積液的胎兒或重度地貧的胎兒。最終納入研究病例181例，其中孤立性CHD146例，伴有心外異常的CHD35例；孕周17+2周-34+3周，平均孕周(23.7±2.9)周；年齡16～44歲，平均年齡(29.8±5.6)周。

1.2研究方法 (1)染色體核型分析：所獲取的羊水和臍血進行細胞培養后，以G顯帶染色(必要時加做C顯帶或N顯帶)制備染色體標本,每例標本按照ISCN(2016)標準,油鏡下分析20個分散好、中等長度的中期分裂相,發現嵌合體或異常核型時加數到100個分裂相。(2)CNV-seq檢測：①提取基因組DNA；②DNA文庫構建；③上機測序；④生物信息學分析；然后通過檢索 UCSC、DECIPHER、OMIM、Clin Var、DGV、PUBMED等數據庫進行CNV臨床意義的確定。

2 結 果

2.1胎兒CHD染色體異常結果 染色體核型分析檢出染色體非整倍體或結構重排共有20例(20/181，11.0%)，包括15例染色體非整倍體(21-三體最常見)，3例染色體大片段的缺失，1例嵌合體、1例22號染色體短臂異染色質。CNV-seq分析技術檢出染色體拷貝數異常43例，檢出率為23.8%(43/181)，其中有明確致病意義的為15.5%(28/181)，臨床意義不明的為3.9%(7/181)，良性變異CNV有8例。染色體核型分析正常的161例CHD 胎兒中，CNV-seq分析技術檢出8例染色體拷貝數微缺失/微重復，檢出率為5.0%(8/161)。

2.2染色體核型分析正常的CHD胎兒中8例致病性CNV結果分析 病例編號13是法絡氏四聯癥，右位主動脈弓，動脈導管未見顯示，CNV-seq分析提示22q11.21處缺失片段大小為2.9Mb區域，包含 22q11 deletion syndrome的全部，涉及TBX1、CDC45L等多個致病基因。病例編號41是胎兒室間隔缺損，CNV-seq分析提示16號染色體p13.3-13.13處重復11.42Mb區域，包含Chromosome 16p13.3 duplication syndrome，主要涉及CREBBP、ABAT等多個致病基因。病例編號50是胎兒肺動脈干增寬，CNV-seq分析提示1號染色體q43-q44處缺失5.86Mb區域，包括了AKT3、NLRP3等多個OMIM基因。病例編號78是胎兒心臟異常，CNV-seq分析提示7號染色體q11.23處缺失1.70Mb區域，包含 Williams-Beuren Syndrome (WBS)的全部，涉及OMIM基因有NCF1、ELN、SVAS、ADCL1。病例編號114是胎兒法洛四聯癥、永存左上腔靜脈、十二指腸梗阻，CNV-seq分析提示2號染色體p16.1-p14處缺失4.48Mb區域，主要涉及SLC1A4、EHBP1等致病基因；病例編號137是永存左上腔靜脈Ib型，CNV-seq分析提示22號染色體q13.2-q13.33處缺失7.94Mb區域，該區域主要涉及SHANK3,PSAP2等多個致病基因；病例編號144也是永存左上腔靜脈Ib型，CNV-seq分析提示5號染色體p15.33處缺失4.42Mb區域，主要涉及SLC9A3、SDHA等基因。

3 討 論

本研究中，181例 CHD 胎兒進行了染色體核型分析及CNV-Seq分析，G顯帶核型分析顯帶水平為320-400條帶，可以較準確地檢測大于10Mb的染色體數目和結構的異常，染色體核型分析異常染色體檢出率為11.0%(20/181)。而通過CNV-Seq分析技術，有明確臨床致病意義的染色體畸變為15.5%(28/181)，臨床意義不明確的為3.8%(7/181)。染色體核型分析正常的CHD致病性CNV檢出率5.0%(8/161)。鄧璐莎等[4]研究57例胎兒先天性心臟發育異常的病例中，NGS測序檢查出CNV結果異常的為19.30%；Zhu等[5]對115例CHD 胎兒進行產前診斷，18.3%(21/115)的致病性CNV被檢測出。Jansen FA等[6]一項meta分析表明染色體核型正常的CHD胎兒額外檢出的致病性CNV為7.0%。這些研究均表明，CHD除了與常見的染色體非整倍體如21-三體等相關外，與染色體亞顯微結構異常密切相關，CNV-seq技術可以提高胎兒CHD染色體異常的檢出率。2019年我國專家共識[7]推薦CNV-Seq技術作為產前診斷的一線技術。因此，對胎兒CHD進行產前診斷，染色體核型分析方法分辨率有限，不能檢出10Mb以下染色體亞顯微結構異常，而CNV-seq技術可作為補充染色體核型分析的有效技術，提高胎兒CHD染色體畸變的檢出率，有助于臨床醫師進行產前遺傳咨詢和風險評估。

在本研究中，CNV-seq分析檢出8例致病性 CNV，片段大小為1.7-11.42Mb，均含有致病性基因。最常見的為22q11.2微缺失，涉及TBX1、CDC45L等多個致病基因，而TBX1基因是22q11.2微缺失綜合征大部分臨床表型的分子病理基礎，是圓錐動脈干畸形最常見的綜合類型[8]，這些遺傳綜合征型的CHD胎兒出生后還可表現為智力障礙、生長發育異常等多種功能障礙，而胎兒時期，CHD只是這其中表型之一。遺傳綜合征型的CHD涉及多個致病基因，嚴重影響胎兒CHD的預后，對家庭及社會都是一種沉重的負擔。對胎兒CHD進行致病CNV的研究，對評估胎兒的預后有重要的意義。雖然CNV-Seq是分析基因組拷貝數變異的高分辨率檢測工具，從速度、自動化程度、極少的樣本量、覆蓋面和分辨率上都比傳統的細胞遺傳學方法有很大程度的提高。但是CNV-Seq分析也有局限性，不能有效測出基因組平衡的染色體倒位及易位、不能檢測一些特殊的三倍體及一些低比例嵌合體、檢出意義不明的CNV(variants of Unknown significance，VUS)等。VUS是CNV-Seq檢測胎兒CHD的額外發現，CNV-Seq技術在胎兒CHD產前診斷的應用給臨床帶來最大的困難也就是VUS的解釋。

綜上所述，運用CNV-Seq技術對胎兒CHD進行產前診斷，較傳統的染色體核型分析方法能顯著提高染色體畸變的檢出率,鑒定疾病相關性CNV，為進一步了解CHD的發病機制提供理論依據，也為CHD的早期診斷、治療和遺傳阻斷提供臨床證據。