環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)呼吸道樣本中肺炎克雷伯菌*

司玉瑩，趙望，葉蓓，成宇，張?chǎng)┭悖~楊芹，王玉超，王嵐，范列英

(1. 同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200120；2. 復(fù)旦大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程系，上海 200438)

呼吸道感染是一種常見(jiàn)并嚴(yán)重威脅人們身體健康的感染性疾病，肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae，Kpn)感染在呼吸道感染中居于前列[1]。目前Kpn臨床檢測(cè)常規(guī)方法是細(xì)菌培養(yǎng)法，需3 d左右，不利于早期診斷和治療；菌種鑒定金標(biāo)準(zhǔn)是DNA測(cè)序法，設(shè)備昂貴、實(shí)驗(yàn)條件嚴(yán)格，不適于基層實(shí)驗(yàn)室推廣應(yīng)用。因此，臨床上需要一種快速可靠的鑒定方法。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)具有特異性強(qiáng)，靈敏度高，擴(kuò)增快速高效，操作容易等優(yōu)點(diǎn)[2]，目前國(guó)內(nèi)已有學(xué)者建立了應(yīng)用于食品中Kpn檢測(cè)的LAMP體系[3]。本研究擬建立一種用于檢測(cè)呼吸道感染Kpn的LAMP方法，同時(shí)與細(xì)菌培養(yǎng)法、DNA測(cè)序法結(jié)果進(jìn)行比較，評(píng)估該體系并初步臨床應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1臨床樣本及菌株 收集2018年5—11月同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院就診的疑似呼吸道感染患者痰液樣本308例，其中男性248例，女性60例，年齡范圍19～95歲，年齡(66.39±12.81)歲。患者入院清潔口腔后采用自然咳痰法用力咳出深部痰或經(jīng)吸痰管、纖維支氣管鏡氣道內(nèi)吸取法采集痰液樣本，根據(jù)第4版《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》[4]初步判斷痰液樣本是否合格。肺炎克雷伯菌ATCC 13883、銅綠假單胞菌ATCC 27853、鮑曼不動(dòng)桿菌ATCC 19606、大腸埃希菌ATCC 35218、金黃色葡萄球菌ATCC 25923、肺炎鏈球菌ATCC 49619、流感嗜血桿菌ATCC 9007、卡他莫拉菌ATCC 25238、產(chǎn)酸克雷伯菌ATCC 700324均購(gòu)自上海北諾生物科技有限公司，用于LAMP法的特異性、靈敏度試驗(yàn)。

1.2主要試劑與儀器 10×ThermoPol Reaction Buffer、Bst2.0 DNA聚合酶(New England Biolab公……