天麻蜜環菌深層發酵生產工藝研究

李進進 鄧愍民 楊明

（江西國藥有限責任公司 南昌 330052）

天麻蜜環菌（Armillaria Mellea）是與著名中藥天麻（Gastrodia Elata Bl.）共生的食藥兩用的美味食用菌，其增養物營養豐富，具有與天麻相似的藥理作用和臨床療效。現代研究表明，蜜環菌中主要含有萜類、甾醇類、多糖、腺苷類和氨基酸類等化學成分，具有鎮靜、降血壓、降血糖、催眠、抑菌、防癌、抗氧化、抗衰老、抗驚厥、抗腫瘤、抗輻射、免疫調節等廣泛的生物活性[1～4]，被廣泛應用于開發保健食品、功能性食品及藥品中。本研究旨在通過正交設計優化天麻蜜環菌的深層發酵工藝條件，建立天麻蜜環菌深層發酵的生產工藝，解決野生資源量受限制的問題。現報道如下：

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌種 天麻蜜環菌，由江西國藥有限責任公司提供。

1.1.2 儀器設備 AUTO T4 全自動細胞計數儀（美國Nexcelom 公司）；TS-100C 恒溫搖床（杭州同祺儀器有限公司）；DHG-9036A 恒溫鼓風干燥箱（上海萬銳實驗室設備有限公司）；YG-1.2 型脈動真空滅菌柜（江蘇神農滅菌設備有限公司）；15 L、50 L 全自動機械攪拌發酵罐（上海國強生化工程裝備有限公司）；高速冷凍離心機（廣州滬瑞明儀器有限公司）；BX43 生物顯微鏡（奧林巴斯公司）；BT25S 賽多利斯電子天平（北京賽多利斯儀器系統有限公司）。

1.1.3 原料及試劑 麩皮、豆粕、玉米粉（五大連池市可信生物技術有限公司）；葡萄糖（山東祥瑞藥業有限公司）；磷酸二氫鉀（KH2PO4）、七水硫酸鎂（MgSO4·7H2O）、蔗糖（國藥集團化學試劑有限公司）；瓊脂、維生素B1（VB1，賽國生物科技有限責任公司）；蛋白胨、酵母膏（梁山科泰生物制品有限公司）。

1.1.4 培養基 斜面培養基：麩皮50 g/L，瓊脂20 g/L，蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L，酵母膏10 g/L，水適量，pH 自然。種子培養基：玉米粉40 g/L，豆粕20 g/L，葡萄糖10 g/L，蔗糖20 g/L，酵母膏3g/L，VB10.03 g/L，KH2PO41.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.75 g/L，豆油4 ml/L，水適量，pH 自然。發酵培養基：玉米粉20 g/L，豆粕10 g/L，葡萄糖10 g/L，蔗糖20 g/L，KH2PO41.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.75 g/L，豆油2 ml/L，水適量，pH 自然。

1.2 檢測方法 含菌量測定：用移液槍移取10 μl充分混勻含有菌絲體的發酵液，加入計數板的加料倉，將計數板插入細胞計數儀的樣品槽，按下計數儀上的計數細胞按鈕，待數據穩定后，記錄含菌量。重復測3 次，取其平均值作為實測含菌量。

1.3 實驗方法

1.3.1 斜面活化培養 取天麻蜜環菌斜面保藏菌種劃線接種于活化斜面，置于恒溫培養箱中溫度（25±1）℃、濕度70%～85%，恒溫靜置培養15 d。

1.3.2 15 L 發酵罐（種子罐）培養 按照10%（體積分數）的接種量接種于15 L 發酵罐，溫度（25±1）℃，轉速100 r/min，溶解氧為5.0～7.0 mg/L，培養6～7 d，每天取樣測定含菌量。

1.3.3 50 L 發酵罐（發酵罐）培養 在50 L 發酵罐中進行深層發酵工藝研究，通過單因素試驗，分別考察溶解氧、晝夜溫差、發酵時間和接種量對含菌量積累的影響。

2 結果

2.1 溶解氧對含菌量積累的影響 在接種量為20%（體積分數）、轉速為100 r/min、溫度（25±1）℃、培養周期為7 d、溶解氧為7 mg/L 時，含菌量呈現最高值。見表1。

表1 溶解氧對含菌量積累的影響

2.2 晝夜溫差對含菌量積累的影響 以晝夜平均溫度25℃為基準，分別采用晝夜溫差0℃、2℃、4℃、6℃、8℃和10℃（相應的溫度分別是25℃/25℃、26℃/24℃、27℃/23℃、28℃/22℃、29℃/21℃、30℃/20℃），在接種量為20%（體積分數）、溶解氧為7 mg/L、培養周期為7 d、晝夜溫差為6℃時，含菌量達最大值。見表2。

表2 晝夜溫差對含菌量積累的影響

2.3 發酵時間對含菌量積累的影響 在接種量為20%（體積分數）、溶解氧為7 mg/L、晝夜溫差為6℃、發酵周期為7 d 時，含菌量達到最高值，之后隨著培養周期的增長，含菌量出現下降的趨勢。見表3。

表3 發酵時間對含菌量積累的影響

2.4 接種量對含菌量積累的影響 在發酵液溶解氧為7 mg/L、晝夜溫差為6℃、培養周期為7 d 時、接種量為15%（體積分數）時，含菌量達到最高值。見表4。

表4 接種量對含菌量積累的影響

2.5 發酵條件的正交試驗優化結果 基于單因素實驗結果，選取溶解氧、晝夜溫差、發酵時間及接種量作為影響因素，以含菌量為評價指標，采用L9（34）正交表優化。結果顯示，對含菌量積累的影響因素作用大小：溶解氧為A3＞A2＞A1、晝夜溫差為B2＞B1＞B3、發酵時間為C3＞C2＞C1、接種量為D1＞D2＞D3。表明發酵時間對含菌量積累的影響最大，其他依次為接種量、溶解氧、晝夜溫差。天麻蜜環菌發酵優化條件為A3B2C3D1，即溶解氧7 mg/L、晝夜溫差6℃、發酵時間7 d、接種量15%（體積分數）。見表5、表6。

表5 正交實驗因素水平表

表6 發酵條件的正交試驗優化結果

2.6 工藝驗證結果 為了檢驗正交結果的可靠性，對分析得出的最優發酵工藝A3B2C3D1，即溶解氧7 mg/L、晝夜溫差6℃、發酵時間7 d、接種量15%（體積分數），進行了三批工藝驗證試驗。三批工藝驗證試驗結果顯示，含菌量與正交結果基本一致。見表7。

表7 工藝驗證結果

3 結論

有研究表明，非致死低溶解氧脅迫是抑制微生物發酵的重要因素。本研究結果表明，在溶解氧＜3.0 mg/L 時，天麻蜜環菌含菌量顯著降低；當溶解氧＞5.0 mg/L 時，實驗天麻蜜環菌含菌量與正常及高氧處理組之間無顯著差異性。許多研究表明，晝夜溫差是影響微生物發酵品質的主要因素。本研究中天麻蜜環菌含菌量隨著晝夜溫差（0～6℃）增大而增大，但在晝夜溫差＞6℃時隨之降低，原因可能是較大的晝夜溫差下晝溫過高，不適宜蜜環菌增殖，增殖速率降低從而導致含菌量降低。合理的發酵周期對微生物發酵品質提升有突出貢獻。本研究中天麻蜜環菌含菌量在0～7 d 隨著發酵時間的延長而增大，但在＞7 d 后隨之降低，原因可能是較長發酵時間下，營養物質消耗過高，不適宜蜜環菌增殖，增殖速率降低從而導致含菌量降低。接種量也是影響發酵罐中天麻蜜環菌生長和含菌量積累最重要的因素之一。接種量過小，不能充分利用發酵液中的營養物質，在相同發酵時間內天麻蜜環菌增量小，要達到最大生長量，會延長發酵時間，降低設備的利用率；接種量過大，天麻蜜環菌競爭有限的營養物質，對天麻蜜環菌的生長不利。天麻蜜環菌含菌量在5%～15%時，隨著接種量的增大而增大，但在＞15%后隨之降低，原因可能是接種量過大，營養物質供給不足。

本研究通過單因素試驗確定了天麻蜜環菌發酵工藝參數的適宜范圍，通過正交試驗對天麻蜜環菌含菌量有顯著性影響的溶解氧、晝夜溫差、發酵時間和接種量4 個發酵工藝參數進行了優化，確定最適培養條件為A3B2C3D1，即溶解氧7 mg/L、晝夜溫差6℃、發酵時間7 d、接種量15%（體積分數）。在此條件下進行了三批工藝驗證，進一步驗證了該發酵工藝的可行性，可以用于工業大生產。