三草尿毒靈通過調控Shh/Gli 信號通路表達減輕腎臟纖維化的實驗研究*

周燕妮 蘇雨田 許正錦

（北京中醫藥大學廈門醫院 福建廈門 361000）

我國慢性腎臟病（Chronic Kidney Disease,CKD）的流行病學調查結果顯示，我國成人CKD 患病率約為10.8%[1]。在全球范圍內，CKD 患者進展到終末期腎?。‥nd Stage Renal Disease,ESRD）的數量每年遞增。而隨著糖尿病和肥胖癥等代謝性疾病發病率的不斷增長，CKD 的患病率將進一步上升[2]。CKD 已經成為“全球公共健康問題”。

腎小管間質纖維化（Tubulointerstitial Fibrosis,TIF）是腎臟受損時發生瘢痕化并重塑的病理過程。TIF 的病理特征是間質組織炎細胞浸潤、腎小管萎縮、肌成纖維細胞激活及細胞外基質成分（Extracellular matrix,ECM）過度堆積，最終由瘢痕組織取代正常的腎臟結構，造成腎功能減退或喪失。大量的臨床和實驗數據表明，TIF 是導致腎功能逐漸喪失的主要決定因素，是各種病因引起CKD 的共同發病途徑[3～5]，其病變程度與病情預后密切相關。

既往研究發現，Shh/Gli 信號在促進腎臟纖維化過程中發揮了重要作用，在多種腎纖維化動物模型中表達上調。如在腎缺血-再灌注（IRI）、單側輸尿管結扎（UUO）等多種腎臟疾病中Shh/Gli 信號都被重新激活[6～7]。此外，在人體腎臟病的標本中，也可以看到Shh 蛋白表達上調。因此，抑制Shh/Gli 信號的激活是防止腎臟纖維化的重要環節。

中醫藥在防治CKD 進展、延緩腎臟纖維化等方面有其獨特優勢[8～9]。三草尿毒靈是全國名老中醫專家學術經驗繼承指導老師趙紀生教授的經驗方，具有健脾益腎、泄濁排毒、活血化瘀的功效。前期的臨床研究和動物實驗表明，三草尿毒靈不僅可減輕臨床癥狀，延緩CKD 的進展，還能有效減少血清透明質酸（HA）、Ⅳ型膠原和轉化生長因子-β1（TGF-β1）的水平[10～13]。本研究通過動物實驗，觀察三草尿毒靈對Shh/Gli 信號表達的影響，從信號轉導通路水平進一步揭示其抗腎纖維化的作用機制，為三草尿毒靈的臨床應用提供基礎理論依據?，F報道如下：

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級雄性BALB/c 小鼠（體質量20～25 g）24 只，購于北京動物實驗中心，飼養于廈門大學醫學院動物實驗中心SPF 級動物房，自由飲水。

1.2 藥物 三草尿毒靈方由黃芪、葫蘆巴、魚腥草、鹿銜草、積雪草、大黃、黃連、法半夏、茯苓、枳實、川芎等組成，購于廈門市中醫院中藥房，煎煮并濃縮成含生藥0.6 g/ml 的湯劑。Shh/Gli 信號小分子抑制劑環巴胺（Cyclopamine,CPN）購于美國Sigma-Aldrich公司。

1.3 分組、手術與用藥 小鼠隨機分為假手術組（簡稱Sham 組）、單側腎缺血再灌注組（Unilateral Renal Ischemia/Reperfusion Injury,UIRI）、單側腎缺血再灌注三草尿毒靈組（簡稱SCNDL 組）和單側腎缺血再灌注CPN 組（簡稱CPN 組），各6 只。小鼠腹腔注射麻醉，暴露腎臟后分離腎蒂。Sham 組只暴露腎蒂但不夾閉腎蒂，用微型動脈夾夾閉左側腎蒂30 min 構建單側腎缺血再灌注模型。UIRI 組術后第3天起每天通過腹腔注射生理鹽水，CPN 組術后第3天起每天通過腹腔注射CPN（按5 mg/kg 注射），SCNDL 組術后第3 天起每天灌胃三草尿毒靈湯劑（按0.15 ml/10 g 灌胃）。術后第10 天，麻醉小鼠后，暴露小鼠右腎，結扎腎蒂后切除右腎。假手術組只做腎包膜剝離，不做腎臟切除。在術后第11 天處死小鼠，收集血液和腎臟組織，用于后續檢測分析。

1.4 檢測指標及方法

1.4.1 血肌酐及尿素氮水平檢測 收集小鼠血液后，常溫靜置2 h，再2 500 rpm，4℃離心15 min，取上清液，用自動生化儀測量小鼠血清肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）水平。

1.4.2 腎組織病理學檢查 腎組織塊浸入4%多聚甲醛固定后，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，制成3 μm 厚切片供常規Masson 染色及免疫組化檢測，操作按說明進行。實驗使用抗Shh 抗體（sc-9024）等抗體。

1.4.3 Western blot 檢測蛋白表達 提取腎組織總蛋白，BCA 法測量蛋白濃度后進行電泳、轉膜、封閉、孵育相應一抗：抗Fibronectin 抗體（F3648）、兔抗CollagenⅢ抗體（ab7778）、鼠抗α-SMA 抗體（A2547）、抗Shh 抗體（sc-9024）、抗Gli 1 抗體（AF3455）、抗α-tubulin 抗體（T9026），以及抗β-actin 抗體（MAB1501）；再孵相應二抗后用ECL化學發光液顯影曝光，凝膠圖像分析系統分析結果。

1.4.4 qRT-PCR 檢測mRNA 的表達 用TRIzol 提取腎臟組織RNA 后，使用Promega 公司的試劑盒將RNA 反轉錄獲得cDNA，再選擇相應引物（見表1）進行qRT-PCR 反應。結果采用內參基因β-actin的表達量作為矯正。

表1 qRT-PCR 所用引物

2 結果

2.1 各組腎功能比較 腎功能檢測結果表明，與Sham 組相比，UIRI 組血肌酐和尿素氮水平明顯升高（P＜0.05）；與UIRI 組比較，SCNDL 組、CPN 組血肌酐和尿素氮水平明顯降低（P＜0.05）；SCNDL 組與CPN 組血肌酐和尿素氮水平比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖1、表2。

圖1 各組腎功能比較

表2 各組腎功能比較（n＝6，±s）

表2 各組腎功能比較（n＝6，±s）

2.2 各組腎臟間質纖維化情況比較 Masson 染色結果表明，UIRI 組、SCNDL 組、CPN 組腎臟間質纖維化面積均大于Sham 組（P＜0.05）；SCNDL 組與CPN 組腎臟間質纖維化面積均小于UIRI 組（P＜0.05）；SCNDL 組與CPN 組腎臟間質纖維化面積比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖2、表3。

圖2 各組腎臟間質纖維化情況比較

表3 各組腎臟間質纖維化評分比較（n＝6，分，±s）

表3 各組腎臟間質纖維化評分比較（n＝6，分，±s）

2.3 各組細胞外基質表達情況比較 UIRI 小鼠的腎組織中，無論是mRNA 水平還是蛋白水平，FN、COL-Ⅲ和α-SMA 表達水平均較Sham 組小鼠顯著升高（P＜0.05）；SCNDL 組和CPN 組mRNA、蛋白水平，FN、COL-Ⅲ和α-SMA 表達水平均低于UIRI組（P＜0.05）；SCNDL 組、CPN 組mRNA、蛋白水平，FN、COL-Ⅲ和α-SMA 表達水平比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖3、表4、表5。

圖3 各組細胞外基質表達情況比較

表4 各組腎組織細胞外基質表達情況比較（n＝6，±s）

表4 各組腎組織細胞外基質表達情況比較（n＝6，±s）

表5 各組腎組織纖維化蛋白表達情況比較（n＝6，±s）

表5 各組腎組織纖維化蛋白表達情況比較（n＝6，±s）

2.4 各組Shh/Gli 信號表達情況比較 qRT-PCR 檢測結果顯示，UIRI 組腎組織Gli 1 mRNA 水平較Sham 組明顯升高（P＜0.05）；SCNDL 組和CPN 組Gli 1 mRNA 水平顯著低于UIRI 組（P＜0.05）；同樣，Western blot 檢測顯示SCNDL 組和CPN 組Gli 1蛋白表達低于UIRI 組（P＜0.05）。SCNDL 組和CPN組Gli 1 蛋白表達水平比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖4、表6。

圖4 各組Shh/Gli 信號表達情況比較

表6 各組腎組織Gli 1 基因表達情況比較（n＝6，±s）

表6 各組腎組織Gli 1 基因表達情況比較（n＝6，±s）

3 討論

Hedgehog（Hh）信號是一組進化上保守的發育相關信號，能夠調節胚胎發育、組織穩態、損傷修復和腫瘤發生等多種生物學過程[14～15]。哺乳動物Hh 信號的配體有三種，分別為Shh、Ihh（Indian hedgehog）和Dhh（Desert hedgehog），其中Shh 的研究最為廣泛。Shh 在細胞外通過與胞膜受體Patched 1（Ptch 1）相結合，誘導Ptch 1 內聚體形成和降解，使其喪失對Smoothened（Smo）蛋白的抑制作用，從而引起Smo 的激活?；罨腟mo 蛋白經過多種步驟進一步激活Gli 轉錄因子家族?；罨腉li 轉錄因子進入細胞核內，誘導靶基因的轉錄。正常情況下，當腎臟發育完成后，Shh/Gli 信號變為靜息狀態。但當腎臟發生病變時，Shh/Gli 信號被重新激活促進腎臟纖維化。在既往的動物實驗研究中，無論是UUO、阿霉素腎病（ADR）、5/6 腎切除模型，還是單側腎缺血再灌注模型，激活的Shh/Gli 信號都會促進腎臟纖維化的發生及發展，而阻斷Shh/Gli 信號則可抑制腎臟纖維化[16～17]。

成纖維細胞的激活在腎臟纖維化發生中有關鍵作用。在正常成年人腎臟中，成纖維細胞位于腎實質毛細血管叢和小管上皮細胞之間的間質區域內，其形態表現為星狀形，并擁有多個細胞突起，連接于腎小管和毛細血管基底膜之間[18]。靜息狀態下，間質成纖維細胞膜表達CD73 抗原，能夠產生促紅細胞生成素，并且表達血小板來源生長因子受體β（PDGFRβ）和成纖維細胞特異蛋白1（FSP 1）。腎臟損傷時，成纖維細胞受到激活，細胞增殖異常活躍，同時其表型發生轉變，表達激活狀態特異的分子標志物α-SMA，并產生大量ECM 蛋白，成為肌成纖維細胞。那么肌成纖維細胞在腎臟受損后是如何激活的，便是腎臟纖維化研究領域中的一個關鍵課題。腎實質的主要組成細胞是腎小管上皮細胞，它們易受多種代謝紊亂、免疫反應、缺血、低氧和腎毒素刺激，是腎臟損傷的主要靶細胞[19]。有學者認為受損腎小管上皮和間充質成纖維細胞存在腎小管上皮-間充質細胞對話（EMC），從而引起成纖維細胞的表型改變。并且Shh 可能是介導EMC 的一個重要介質。在腎臟纖維化發生過程中Shh 在腎小管上皮細胞的表達明顯增高，而它的靶細胞為成纖維細胞，能夠誘導成纖維細胞活化。這些結果提示，腎小管來源的Shh 通過EMC 對成纖維細胞激活和增生可能起到了至關重要的作用。

三草尿毒靈全方通補兼施，方中既有黃芪、葫蘆巴健脾溫腎以扶正，又有魚腥草、鹿銜草、積雪草、大黃清熱解毒、通腑泄濁以祛邪；配以黃連、法半夏、茯苓、枳實顧護脾胃，使中焦樞紐運轉正常，以防閉門留寇；又因久病多瘀，佐以川芎活血化瘀，血運通暢有利于濁毒之邪排出。正邪兼顧，補、泄融為一體，使補而不留邪，泄而不傷其正。此方不僅延緩了CKD的進展，而且對一系列并發的臨床癥狀有明顯的緩解和消除作用。

前期體外研究發現，三草尿毒靈能抑制Shh 引起的腎成纖維化細胞的增殖以及Shh 信號的傳導。本研究發現，在單側腎缺血再灌注模型中，UIRI 小鼠血肌酐和尿素氮水平明顯升高，在分別給予三草尿毒靈和Shh/Gli 信號通路抑制劑CPN 治療后，UIRI 小鼠的血肌酐和尿素氮水平明顯下降，起到了保護腎功能的作用。此外三草尿毒靈和CPN 還可減輕UIRI 小鼠的腎臟細胞外基質的沉積，抑制腎臟纖維化進展。進一步研究發現，三草尿毒靈與CPN 一樣，都可阻斷Shh/Gli 信號通路等表達，從而改善腎臟纖維化。

總之，Shh/Gli 信號通路在促進腎臟纖維化的發生發展中發揮了關鍵作用，調控Shh/Gli 信號通路等表達是防止腎臟纖維化等的重要靶點。三草尿毒靈作為中藥復方，含有多種有效成分，在延緩慢性腎臟病進展方面具有獨特優勢。前期研究表明本方具有減少ECM 形成、降低TGF-β1水平的作用。通過本次動物實驗研究，進一步證實三草尿毒靈能保護單側腎缺血再灌注小鼠的腎功能，并能阻斷Shh/Gli信號通路的表達，從而減輕腎臟纖維化，說明其抗腎纖維化的作用機制與調控Shh/Gli 信號的表達密切相關。