多重PCR-毛細管電泳檢測兒童5種腹瀉病毒的方法建立及應用*

蔡德豐，陳運生，朱純青，孟青，肖麗霞，田潔，馬東禮

(1. 深圳市兒童醫院檢驗科，深圳 518038；2. 亞能生物技術(深圳)有限公司，深圳 518000)

急性腹瀉在全球均有較高的發病率和死亡率，主要發生在兒童和老年人群[1]。目前引起嬰幼兒及兒童腹瀉的最常見病毒包括輪狀病毒(rotaviruses，RV)、諾如病毒(norovirus，NoV)、腸道腺病毒(adenoviruses，Adv)、扎如病毒(sapovirus，SV)及星狀病毒(human astroviruses，HAstV)[2-3]。目前約40%的腹瀉并不能快速準確診斷出病因[4-5]。病毒的分離培養及鑒定周期較長；免疫學方法在窗口期通常不能反映現癥感染；單病原體的PCR方法檢測通量較低。本研究首次以兒童常見腹瀉病毒RV、NoV、Adv、SV及HAstV作為診斷目標，建立多重PCR-毛細管電泳法檢測體系，以提高兒童腹瀉病毒診斷的效率。

1 材料和方法

1.1臨床樣本與標準毒株 收集2017—2018年深圳市兒童醫院185例兒童感染性腹瀉(診斷標準：感染性腹瀉診斷標準，WS 271-2007)樣本；Adv、NoV G1、NoV G2、RV A、SV及HAstV的標準毒株(參考品)購于廈門至善生物公司。特異性評價的細菌株及毒株腸致病型大腸埃希菌、痢疾志賀菌、副溶血弧菌、腸炎沙門菌及腸道病毒71型來自深圳市兒童醫院檢驗科微生物實驗室。

1.2主要試劑和儀器 Hotstart HiTaq一步法RT-PCR Mix(廣東菲鵬生物公司)，引物由英濰捷基貿易有限公司(上海)合成，瓊脂糖(西班牙索萊寶生物公司)，磁珠法病毒總核酸提取試劑盒(廣州美基生物公司)，TGuide S32半自動樣本提取儀(北京天根生物公司)；QSEP 100毛細管電泳儀、S1 High resolution凝膠卡匣(中國臺灣光鼎公司)。測序送上海生工生物公司。

1.3核酸提取 將10 μL參考品稀釋至200 μL；配制108/mL各細菌水溶液，95 ℃ 10 min，12 000 r/min 10 min。取200 μL稀釋后參考品、腹瀉樣本及細菌提取液于TGuide S32半自動樣本提取儀上提取核酸，參照磁珠法病毒總核酸提取試劑盒說明書進行。……