補腎陽中藥治療促性腺激素缺乏型男性不育的網絡分子機制初探

孟雪丹 張文婷 趙崇軍 王昭懿 馮丹 趙霞 顧念念 吳怡青 鄒迪新 林瑞超

中醫認為，腎為先天之本，主生殖，腎陽是腎氣的基礎，認為是男性生育的“源頭”，即腎陽是精子發生的根本，直接決定男性生育力。中醫臨床辨證治療男性不育十分重視運用補腎陽中藥，認為腎陽之虛得補，從而消除或改善男性不育。

中西醫結合臨床研究發現，多種補腎陽中藥對促性腺激素缺乏型男性不育具有較好的療效[1]。現代藥理研究發現補腎陽中藥治療促性腺激素缺乏型男性不育的藥效機理在于補腎陽中藥具有促性腺激素樣作用。例如，肉蓯蓉具有補腎壯陽、強肝腎益精氣等作用，其苯乙醇苷類成分可增強下丘腦-垂體-腎上功能，促進體內相關遞質和激素的釋放[2]；淫羊藿中的淫羊藿苷有性激素分泌促進作用并可產生性激素樣作用，通過抑制性腺細胞衰老基因的表達，延遲性腺衰老[3]；鎖陽中含有性激素樣成分及中間體，可直接與受體結合作用，亦可作為合成性激素的原料，還可促進體內原有性激素發揮作用[4]；杜仲具有促進雄性激素合成或釋放的作用，該作用機制與其陰莖神經傳導通路的良好保護作用有關[5]；補骨脂所含的補骨脂素可能參與誘導大鼠間充質干細胞向雄性生殖細胞方向的分化[6]；鹿茸中含有雄性激素、雌激素和孕激素等甾體化合物，鹿茸的激素樣作用與其所含甾類衍生物密切相關[7]；海馬中化學成分種類繁多，包括氨基酸、甾體類、脂肪酸、微量元素和磷脂等，這些有效成分是海馬發揮藥理作用的基礎，海馬在補腎壯陽方面具有很高的價值，可通過提高機體的性激素水平，改善和提高性功能[8]。

促性腺激素缺乏型男性不育的發病機制[9]復雜，涉及大腦皮質-下丘腦、嗅腦-下丘腦、下丘腦-垂體-睪丸等結構的綜合調控。現有的治療策略，實質上是一種類似于“補充式”的辦法，往往不能從根本上治療。因此，如何在根本上綜合調控促性腺激素，是有待解決的重要科學問題。著眼于整體發揮綜合調控作用的中藥被認為是治療的新希望[10]。然而，由于中藥具有化學成分復雜，多成分-多靶點的作用特點，目前補腎陽中藥促性腺激素樣作用的藥效物質基礎尚不明確，其藥理分子網絡機制等關系未見國內報道。生物信息學基于分子間相互作用，可以將復雜的成分和目標蛋白或基因進行網絡構建，在多組學和系統生物學間加以聯系，幫助研究人員更好了解多成分藥物的機制，適用于多成分多靶點特征的中藥研究。本研究從探討分子機制角度出發，通過檢索相關權威數據庫并使用通路分析軟件(ingenuity pathway analysis，IPA)構建補腎陽成分中受美國食品藥品監督管理局(Food and Drug Administration ，FDA)批準的藥物的促性腺激素樣作用靶標網絡關系，從整體上分析補腎陽中藥可能發揮促性腺激素樣作用的成分、作用靶點以及信號通路，初步探討補腎陽中藥改善促性腺激素缺乏男性不育的系統藥理學機制，為補腎陽中藥治療促性腺激素缺乏型男性不育奠定理論基礎和實驗依據，具有一定的科學意義。

1 資料和方法

1.1 數據準備

1.1.1 建立常見補陽中藥已知化學成分數據庫 于中國科學院上海有機化學研究所化學專業數據庫( http：//www.organchem.csdb.cn)中藥與化學成分數據庫-中藥材檢索模塊中，分別檢索淫羊藿、鎖陽、肉蓯蓉、杜仲、補骨脂、鹿茸、海馬7味中藥，整理出每味藥中的已知化學成分列表，包含化合物名稱、分子式、CAS號等信息。

1.1.2 收集已知治療促性腺激素缺乏藥物的靶點 可治療促性腺激素缺乏(gonadotropin deficiency)的藥物靶點來自人類孟德爾遺傳數據庫(Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM，http：//www.omim.org/)、DrugBank數據庫(http：//www.drugbank.ca/)。在DrugBank數據庫中搜索時，僅選取受FDA批準的藥物所對應的靶點，并于UniProt數據庫(http：//www.uniprot.org/)中檢索各靶點，完善其基因名稱、ID等信息。

1.2 分析條件

將補陽中藥單體成分分為植物成分和動物成分兩組，分別與促性腺激素缺乏的已知藥物治療靶點于IPA中進行“Path Explorer”分析，其中作用方式選擇“直接”和“間接”，對靶標的調節選擇“上調”和“下調”。整理出作用關系后，使用IPA中的“molecule activity predictor”功能，預測有效成分單體對靶標表達的調整作用。最后使用IPA中的“core analysis”功能，對靶標進行通路富集等相關分析。

2 結果

2.1 數據整理

對收集到的治療促性腺激素缺乏的藥物治療靶點進行去除重復處理，得到已知治療靶標可在IPA中被識別的有561個；各常見補陽中藥單體成分數量分別為：淫羊藿(57)、杜仲(65)、肉蓯蓉(22)、鎖陽(12)、補骨脂(25)、鹿茸(47)、海馬(14)，其中IPA可識別的各常見補陽中藥單體數量分別為：淫羊藿(10)、鎖陽(6)、肉蓯蓉(9)、杜仲(16)、補骨脂(11)、鹿茸(37)、海馬(9)。

2.2 基于IPA的補陽中藥與疾病靶標的作用關系

通過IPA中“Path explorer”和“molecule activity predictor”功能，將上述靶標和成分分別導入IPA分析模塊，匹配出植物藥、動物藥對已知藥物治療靶點進行直接和間接調節的中藥單體成分，植物藥中，可作用于靶標分子的單體成分為14個，單體及其在實驗選取的補腎陽中藥中的分布見表1，共可調節31個靶標；動物藥中，可作用于靶標分子的單體成分為16個，單體及其分布見表2，共可調節43個靶標。它們的作用關系如圖1、圖2所示，其中橙色為上調，藍色為下調，直線代表直接作用，虛線代表間接作用，筆者在IPA提供的相互作用關系基礎上添加細胞結構示意圖，并將各個靶標定位在其對應的細胞結構中，使其層次更加明確。各靶標對應的蛋白或分子均按照其在細胞中的分布區域標注于圖上。

表1 植物類藥所含單體成分中英文名稱及其歸屬

表2 動物類藥所含單體成分中英文名稱及其歸屬

注：黃色：單體名稱；白色：靶標名稱

圖1植物藥中單體成分-疾病靶標作用關系

注：黃色：單體名稱；白色：靶標名稱

圖2動物藥藥中單體成分-疾病靶標作用關系

2.3 基于IPA的靶點核心分析

通過IPA中“core analysis”功能，對植物藥和動物藥可調節的靶標分別進行通路富集及分析，選取-Logp值及ratio值(代表該通路中可與數據匹配上的靶點個數與通路靶點及分子總個數的比值)作為指標，左側y軸為-Logp值，右側y軸為ratio值，按照-Logp值從大到小的順序排序從IPA中導出前十名通路的柱形圖，見圖3、圖4。植物藥和動物藥2組通路中相關性最高的分別為芳基烴受體信號通路和孕烷X受體/類視黃醇X受體激活途徑，相關性降序前十名中共有通路為血小板反應蛋白1(TSP1)抑制血管生成途徑和缺氧誘導因子1-α(HIF1α)信號途徑。

圖3 植物藥靶標經IPA富集的通路(1～10)

圖4 動物藥靶標經IPA富集的通路(1～10)

分別統計植物藥和動物藥富集到的前十名通路中可匹配到的靶標蛋白的名稱和出現頻數，將出現次數為2及以上的靶標及可受2種及以上中藥單體成分調節的靶標進行整理，如表3、表4所示，表中提供了各靶標蛋白于前十名通路中的出現頻數，以及各補陽藥材中對應中藥單體的存在情況。

表3 植物藥單體成分調控的核心靶標及其歸屬

表4 動物藥單體成分調控的核心靶標及其歸屬

3 討論

中醫認為腎為臟腑之本，十二經之根，對各臟腑有推動和溫煦作用，與現代醫學的男性生育力高度關聯。腎陽衰微，命火不足，內生陰寒等原因造成腎陽虛證，是促性腺激素缺乏型男性不育的主要病機[11]。促性腺激素(gonadotropin，Gn)是一類糖蛋白激素，男性促性腺激素包括卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone，FSH)、促黃體激素(luteinizing hormone，LH)，其合成和分泌涉及大腦皮質-下丘腦、嗅腦-下丘腦、下丘腦-垂體-睪丸等結構的綜合調控，任何一個環節出現紊亂，都可能引起促性腺激素失調和性腺機能障礙，導致促性腺激素缺乏型男性不育。由于其發病機制復雜，單純外源性補充某種男性促性腺激素很少能夠獲得滿意的療效，因此仍是男科臨床上面臨的難點[12]。越來越多的臨床和實驗證據表明，補腎陽藥具有促性腺激素樣作用，且補腎陽中藥對促性腺激素的多成分-多靶點的綜合調節作用，使得補腎陽藥逐漸引起科研和中西醫臨床的關注[11]。生命是由各種分子互相作用共同構成的一個復雜網絡體系，而疾病的出現往往伴隨著多分子水平的變化，涉及到多種具有關聯性的病理過程[13]。生物信息學可基于已知的分子、蛋白、化合物等之間的互作機制，對目標成分與分子進行檢索和關聯性分析，這種整合的分析方法與探索中藥機制與藥理作用的目標相符。

本研究通過生物信息學方法對補腎陽中藥改善促性腺激素缺乏作用的分子機制進行了初步探討，結果發現補腎陽中藥化學庫中的30個化學成分可對FDA批準用于治療促性腺激素缺乏男性不育的藥物靶標庫的60個核心靶點直接激活或抑制，參與HIF1α信號途徑、TSP1抑制血管生成途徑、芳基烴受體信號途徑，孕烷X受體/類視黃醇X受體激活等18條通路的直接調控。在此基礎上，以藥物成分在單味中藥的分布為分析對象，發現在植物類補腎陽藥中分布頻率較高的化學成分是槲皮素、山奈酚、熊果酸、亞油酸、咖啡酸、綠原酸和琥珀酸；動物類是β-雌二醇、前列腺素E2、煙酸、精胺、L-精氨酸和膽固醇。以藥物靶標為分析對象，發現植物類與動物類補腎陽藥在治療促性腺激素缺乏型男性不育過程中直接作用次數較多的靶標是腫瘤蛋白p53(tumor protein p53，TP53)，基質金屬蛋白酶9(matrix metallopeptidase 9，MMP9)，雌激素受體1(estrogen Receptor 1，ESR1)、核受體亞家族1第一組成員2(nuclear receptor subfamily 1 group I member 2，NR1I2)。以藥物通路為分析對象，發現植物類與動物類補腎陽藥在治療促性腺激素缺乏型男性不育過程中均調控的信號通路有4條，分別是HIF1α信號途徑、TSP1抑制血管生成途徑、芳基烴受體信號途徑和孕烷X受體/類視黃醇X受體激活途徑。另外，為了保證研究結果的可靠和準確，本研究只關注了與藥物成分有直接關系的靶標，即實驗數據來源于SCI發表的研究性論文(影響因子大于3分)，因此，本部分研究對這些藥物成分、靶標及通路予以了更多關注。

腫瘤蛋白p53基因和MMP-9均為垂體腺瘤相關的常見抑癌基因。TP53是一種腫瘤抑制基因，表達的p53蛋白可保持基因組的穩定性，避免突變發生。垂體腺瘤是位于腦垂體的良性腫瘤，發生率較高，以中年人居多，解剖發現率約為20%～30%[14]。但有部分腫瘤有侵襲性生長的特性，可能對垂體組織產生壓迫，導致垂體促激素的減少，其主要的臨床表現為性腺功能低下。垂體腺瘤中p53的陽性率與腫瘤的惡性程度成正比關系，嚴重情況如垂體癌中，p53陽性率可達100%[15]。p53分為野生型和突變型，二者作用各不相同：野生型p53可抑制腫瘤發生，平時表達水平較低；突變后的p53則可通過刺激細胞生長的方式促進腫瘤的發生。淫羊藿、鎖陽、杜仲、補骨脂中含有的槲皮素、熊果酸、咖啡酸、亞油酸，鹿茸中的前列腺素E2，這些中藥單體成分對p53既有上調作用也有下調作用，與文獻依據相符[16]。MMP-9屬于Ⅳ型膠原酶，是鋅依賴性內肽酶家族的一員，可介導細胞外基質的降解和血管生成[17]，在垂體腺瘤的侵襲性生長中起重要促進作用[16]。實驗結果顯示，淫羊藿中的槲皮素，鎖陽、杜仲中的熊果酸，鹿茸中的前列腺素E2等成分對MMP-9有抑制作用，與現已知的機制相符。

雌激素受體α(estrogen receptorαlpha，ERα)由雌激素受體1基因(ESR1)編碼，主要分布在細胞核內，在不同器官和生理發育過程中發揮作用，如生殖系統、中樞神經系統等，在男性中的生殖器官、下丘腦、垂體等中均有表達[18]。ERα水平的降低造成機體對雌激素不敏感，同時伴有促性腺激素分泌異常，男性患者會伴有精子活力差，且外源性激素治療對其效果不佳[19]。淫羊藿中的槲皮素、杜仲中的山奈酚，可上調ESR1的表達，猜測可能通過增加ERα的表達，提高機體對雌激素敏感性，進而調整促性腺激素分泌。TP53和ESR1共同參與芳基烴受體信號途徑，在沒有雌激素或雌激素水平過低的情況下，配體與該受體結合，形成芳基烴受體復合物可與雌激素受體結合，激活對雌激素效應元件有依賴性的一系列基因的轉錄。

孕烷X受體是由NR1I2編碼的轉錄因子，屬于核受體。通過與配體結合參與藥物代謝相關酶和轉運蛋白的表達。孕烷X受體于肝和小腸中表達活躍，部分中草藥活性成分經腸道及其他靶器官攝取后作為配體可激活孕烷X受體，從而影響藥物的代謝和作用[20]。鹿茸中的β-雌二醇可上調NR1I2的表達。在孕烷X受體/類視黃醇X受體激活途徑中，激活的孕烷X受體與類視黃醇X受體可共同誘導細胞色素P450 3A4酶(Cytochrome P450 3A4，CYP3A4)的表達，CYP3A4負責近過半數常用藥物的I期代謝，推測其可通過該途徑，在一定程度上提升機體對其他可吸收有效成分的利用。

本研究結合生物信息學方法成功構建了補腎陽中藥治療促性腺激素缺乏型男性不育的“成分-靶標”分子網絡，為補腎陽中藥抗促性腺激素缺乏型男性不育的治療奠定理論基礎和實驗依據，具有一定的科學意義。