截斷逆挽方含藥血清對D-氨基半乳糖誘導的人正常肝細胞LO2細胞增殖影響

吳夢麗 梁嘉俊 魏飛力 楊文龍 杜宇瓊 張秋云

慢加急性肝衰竭(acute-on-chronic liver failure，ACLF)是在慢性肝病的基礎上發生急性肝功能衰竭的一組臨床綜合征，病死率極高[1]。在中國，HBV-ACLF為其最常見類型[2]，且目前發病機制尚不明確。現多認為肝細胞大量死亡是ACLF的核心事件，同時伴肝細胞增殖障礙致其再生不足[3]。該病目前沒有特異療法，主要以支持治療和肝移植為主[4]。但有研究顯示ACLF發生時肝細胞可進行增殖并修復肝組織損傷[5]，通過調節肝細胞增殖，從而改善肝臟急性損傷是阻止ACLF進一步發展的關鍵途徑之一[6]。而轉錄因子E2F1是調控細胞增殖的關鍵轉錄因子，能促使細胞從G1期向S期轉換，加快細胞增殖進程[7]。本課題組前期動物實驗發現截斷逆挽方能抑制ACLF模型大鼠肝細胞的過度凋亡，促進肝細胞的代償性增殖，極大地減輕并逆轉ACLF模型大鼠肝細胞的損傷[8-10]。本研究在此基礎上利用體外細胞實驗進一步觀察截斷逆挽方含藥血清調控E2F1介導的細胞增殖，減輕D-氨基半乳糖(D-Galactosamine，D-GlaN)誘導的人正常肝細胞LO2細胞損傷的作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞及動物

LO2細胞，由首都醫科大學中醫藥學院肝病實驗室贈送。

雄性Wistar大鼠20只，體重250～280 g，SPF級，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物許可證號：SCXK(京)2016-0006，飼養于首都醫科大學實驗動物科學部SPF級動物室。

1.2 實驗藥物及試劑

截斷逆挽方組成：苦味葉下珠30 g、瓜蔞30 g、金錢草30 g、生黃芪30 g、槲寄生30 g、三七6 g、莪術6 g、丹參20 g、生地黃20 g、黑附片先煎15 g，購自于北京同仁堂中醫醫院藥房，經國醫大師金世元生藥鑒定。在首都醫科大學中醫藥學院實驗中心水煎提取。根據前期實驗結果[10]，確定中藥組每只大鼠按照體重每日給予21.7 g/(kg·d)中藥劑量效果最佳，水煎液濃縮成4.34 g/mL，盛裝在滅菌玻璃瓶內，4℃冰箱冷藏備用，使用前熱水浸泡，搖勻。

DMEM高糖培養基(Hyclone，美國)、PBS(HyClone，美國)、胎牛血清(Excell Bio，澳洲)、Cell Counting Kit-8(cck8)(Dojindo，日本)、D-GlaN(Sigma，美國)。Real-time PCR相關試劑：RNApre Pure培養細胞/細菌總RNA提取試劑盒(TIANGEN)、FastKing RT Kit(TIANGEN)、SuperReal PreMix Plus(TIANGEN)均購自于天根生化科技有限公司。蛋白印跡法一抗：E2F1 Rabbit mAb(CST，美國)、β-Actin Rabbit mAb(CST，美國)、DP1 Rabbit mAb(CST，美國)。

1.3 主要實驗儀器

低溫離心機(Heraeus，Biofuge 15r)、酶標儀(SpectraMax iD3，美國)、流式細胞儀(BECKMAN COULTER，美國)、RT PCR儀(BIO-RAD，美國)、垂直電泳槽(Bio-Rad，美國)、Fujifilm成像系統(LAS-3000，日本)。

1.4 方法

1.4.1 含藥血清的制備 Wistar大鼠隨機分成空白對照組和截斷逆挽方組，每組10只。灌胃給藥，1 mL/100 g體重/次，每日兩次灌胃。空白對照組灌服生理鹽水，按照1 mL/100 g體重/次，每日2次。各組連續3天。末次灌胃2小時后，麻醉，采集腹主動脈血，4℃靜置4小時，以3000 r/min速度4℃離心30分鐘，吸取上清液，超凈臺微孔濾膜過濾除菌，56℃水浴滅活30分鐘，室溫冷卻，標記分裝，置于-80℃冰箱保存備用。

1.4.2 LO2細胞的培養 LO2細胞復蘇后置于25 cm培養瓶內，每瓶添加5 mL含10%胎牛血清的DMEM培養基，37℃、5%CO2的細胞培養箱中培養，待細胞融合至80%左右，按照1∶3比例傳代。

1.4.3 D-GlaN誘導LO2細胞損傷模型 取指數生長期的LO2細胞，以8000個/孔的細胞懸液接種于96孔板中，置于培養箱培養12小時后，棄舊液。每孔加入100 μL不含血清的培養基饑餓12小時，以使細胞周期同步。用含10%FBS的DMEM以100 μL/孔的量加入96孔板培養24小時后棄舊液。用含10%FBS的培養基稀釋成不同濃度的D-GlaN工作液(30、60、90、120、150 mmol/L)為實驗組，另設不含D-GlaN工作液的為對照組，無細胞的空白組，每組設6個復孔。D-GlaN工作液分別作用于各組細胞8小時后，用PBS洗兩次，然后每孔加入10%的CCK8工作液孵育2小時后于酶標儀450 nm處測定各孔的吸光度， 計算細胞存活率， 細胞存活率=(實驗組OD值-空白組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)×100%，以篩選出D-GlaN的最合適造模濃度。實驗重復3次。

表1 RT-PCR各基因引物序列

1.4.4 分組及給藥 待細胞生長至指數期時，胰酶消化，調整細胞濃度為4×105個/mL接種于培養瓶中，隨機分為5組：正常組、模型組、2.5%JDNWF、5%JDNWF、10%JDNWF。在含10%FBS的DMEM培養基培養12小時后，吸棄舊培養基，加入無血清的DMEM培養基繼續培養12小時，以同步各組細胞周期，12小時后棄舊液。正常組加入含10%大鼠血清的DMEM培養基，模型組加入含10%大鼠血清的DMEM培養基，2.5%JDNWF加入含有2.5%的截斷逆挽方含藥血清的DMEM培養基，5%JDNWF加入含有5%的截斷逆挽方含藥血清的DMEM培養基，不足10%的用空白對照大鼠血清補足。10%JDNWF加入含有10%的截斷逆挽方含藥血清的DMEM培養基。除正常組外其余各組均加入上述造模濃度的D-GlaN進行干預。

1.5 指標檢測

1.5.1 CCK8法檢測細胞存活率 各組細胞處理后，吸棄舊培養基，PBS清洗2遍，按照10∶1的比例配制CCK8溶液，每孔110 μL，37℃孵育2小時后測定OD值。

1.5.2 流式細胞儀檢測各組細胞周期 各組細胞處理后，棄舊液，胰酶適度消化，培養液吹打，800 r/min，離心15分鐘去上清。PBS洗2次，加0.5 mL的PBS吹勻后用力打入5 mL已預冷的70%乙醇中，4℃固定過夜。固定后1000 r/min離心5分鐘，棄上清，PBS洗2次，加入1 mL RNAse溶液(20 μg/mL)，37℃反應30分鐘后室溫冷卻。加入0.1 mL的PI染液，染色30分鐘后上流式細胞儀檢測。

1.5.3 Real-Time PCR檢測各組E2F1、CDK2、cyclin A、cyclinE、CDC25A基因的表達 各組細胞處理后，根據總RNA提取試劑盒說明書操作步驟進行。細胞總RNA提取后根據逆轉錄說明書進行配液，將總RNA反轉成cDNA。配制Real Time PCR反應液，反應條件為95℃(15分鐘)，95℃(10秒)、60℃(20秒)、72℃(30秒)40個循環。反應完成后使用，得到樣本目的基因和內參CT值，根據2-△△CT法檢測目的基因的相對表達水平。引物序列，詳見表1。

1.5.4 Western Blot檢測各組細胞DP1蛋白表達情況 各組細胞藥物干預后，棄舊液，PBS洗2次，加入裂解液，裂解10分鐘后刮取細胞，離心取上清液，蛋白定量后加入適量的Loading Buffer，將其置于金屬浴中，100℃、10分鐘進行蛋白變性。配制10%的分離膠和濃縮膠，每個樣本取20 μg蛋白開始上樣電泳，電泳條件為90 V、30分鐘，120 V、60分鐘。電泳結束后進行轉膜，轉膜條件為300 mA、60分鐘。轉膜后剪去目的蛋白和內參條帶，以5%脫脂牛奶進行封閉1小時，TBST清洗3次，每次10分鐘。之后孵育一抗，4℃過夜。復溫1小時后，TBST清洗3次，每次10分鐘。二抗孵育1小時后TBST清洗3次，每次10分鐘。配制ECL發光液隨后進行蛋白條帶曝光。

1.6 統計學處理

2 結果

2.1 CCK8法檢測D-GlaN對LO2細胞活力的影響

CCK8結果顯示，D-GlaN能夠導致細胞活性下降，并呈濃度依賴性。但當D-GlaN濃度達到60 mmol/L時，細胞活力下降趨勢最顯著，與對照組比較有顯著性差異(P<0.01)。此外有研究表明D-GlaN在該濃度條件下可避免肝細胞壞死并最大限度地引起引起肝細胞損傷[11]。故后續實驗采用60 mmol/L的D-GlaN濃度作為造模濃度。結果見表2。

表2 CCK8法檢測D-GlaN對LO2細胞活力的影響

注： 與對照組相比，aP<0.01。

2.2 CCK8法檢測各組D-GlaN誘導LO2細胞存活率比較

CCK8結果顯示，與模型組相比，不同濃度截斷逆挽方含藥血清組的細胞存活率均有所升高(P<0.05，P<0.01)，但含藥血清濃度為5%時細胞存活率升高幅度最大。這表明截斷逆挽方含藥血清能增強LO2細胞活力，改善肝細胞損傷情況，但以5%濃度的含藥血清效果最佳。結果見表3。

表3 各組D-GlaN誘導LO2細胞存活率比較

注： 與正常組相比，aP<0.01；與模型組相比，bP<0.05，cP<0.01。

2.3 各組D-GlaN誘導LO2細胞周期比較

流式細胞術結果顯示，模型組較正常組G1期比例明顯減少(P<0.05)，但是S期和G2期無明顯變化。截斷逆挽方含藥血清組較模型組G1期細胞比例明顯增加(P<0.05，P<0.01)。2.5%JDNWF組與模型組比較，S期和G2/M期細胞比例無明顯變化。5%JDNWF和10%JDNWF組與模型組比較，S期和G2/M期細胞比例均顯著增加(P<0.01)，但5%JDNWF組S期細胞比例較10%JDNWF組增加更加明顯。這提示截斷逆挽方含藥血清可加快細胞進入G1期的進程，并且濃度越高，細胞向S期轉換的進程越快。見圖1和表4。

組別nG0/G1(%)S(%)G2/M(%)正常組348.07±1.3143.53±0.748.42±1.51模型組351.70±0.90a39.47±1.768.82±0.862.5%JDNWF346.73±2.40c43.00±3.4610.26±1.555%JDNWF335.23±3.18d53.13±5.18d11.62±2.03d10%JDNWF340.5±0.95d47.83±0.06d11.66±0.98d

注： 與正常組相比，aP<0.05，bP<0.01；與模型組相比，cP<0.05，

dP<0.01。

2.4 各組D-GlaN誘導LO2細胞E2F1、cyclin E、cyclin A、CDK2、CDC25A mRNA表達的影響

PCR結果顯示，模型組E2F1、cyclin E、cyclin A、CDK2、CDC25A mRNA與正常組相比表達均下降，差異顯著(P<0.01)。截斷逆挽方含藥血清組E2F1、cyclin E、cyclin A、CDK2、CDC25A mRNA與模型組相比表達均上調，差異顯著(P<0.01)；但以5%的截斷逆挽方含藥血清組各基因的mRNA表達上調最明顯。結果見表5。

表5 各組D-GlaN誘導LO2細胞E2F1、cyclin E、cyclin A、CDK2、CDC25A mRNA的相對表達量比較

注： 與正常組相比，aP<0.01；與模型組相比，bP<0.05，cP<0.01。

2.5 Western Blot檢測截斷逆挽方含藥血清對D-GlaN誘導LO2細胞DP1蛋白表達情況

Western Blot結果顯示，與正常組相比，模型組DP1表達量有所下降(P<0.01)；與模型組相比，截斷逆挽方含藥血清組DP1表達量均有所上升(P<0.05，P<0.01)。實驗重復3次，結果見圖2和表6。

注：A：正常組；B：模型組；C：2.5%JDNWF；D：5%JDNWF；E：10%JDNWF

圖2 各組D-GlaN誘導LO2細胞DP1蛋白 表達免疫印跡電泳表6 各組D-GlaN誘導LO2細胞DP1蛋白的 相對表達量(IOD值)

注： 與正常組相比，aP<0.01；與模型組相比，bP<0.05，cP<0.01。

3 討論

現代研究表明慢加急性肝衰竭的病理特點是大量的肝臟細胞壞死、過多凋亡和再生不足[12]，該病西醫目前尚無有效的治療手段。截斷逆挽方是全國名中醫錢英教授根據ACLF“毒瘀和正虛交織”的病機特點擬定的基礎方[13]，全方由苦味葉下珠、瓜蔞、金錢草、生黃芪等組成，共奏清熱解毒、涼血化瘀、調補氣血陰陽之效，早期快速截斷病勢，同時固護人體氣血，扭轉危局[14]。臨床研究發現該方能在一定程度上改善肝功能、降低病死率[15]，而且課題組前期進行動物實驗研究表明該方能降低ACLF模型大鼠的炎癥因子如白細胞介素6、腫瘤壞死因子-α水平，保護肝功能，減輕肝細胞損傷[8-10]，但具體機制不清。本實驗中，CCK8法檢測進一步發現截斷逆挽方含藥血清能顯著增強肝細胞活力，進一步表明該方能保護肝細胞并逆轉肝細胞損傷。

此外，在實驗中還觀察到明顯的肝細胞增殖現象。既往的研究顯示，肝臟未處于病理狀態時，肝細胞處于G0期。當ACLF發生時，各種刺激性因素作用于肝臟，則會進一步出現肝細胞的壞死和過度凋亡，同時會刺激殘存的肝細胞重新進入增殖狀態來延緩肝臟損傷速度，恢復肝功能。但是，一旦肝細胞壞死超過肝細胞的再生能力時則會引起肝功能急劇惡化導致肝衰竭的發生。因此結合本實驗結果，推測逆挽方保護肝細胞的作用可能系其促進肝細胞增殖所致。通過流式細胞術，發現截斷逆挽方含藥血清組能促進細胞從G1期向S期的轉換。肝臟未處于病理狀態時，肝細胞處于G0期，而E2F1作為轉錄激活子，通過轉錄激活細胞周期蛋白如cyclin E、cyclin A、cyclin D的表達等促進細胞進入S期。但是E2F1只有與DP1結合形成E2F1/DP1二聚體時才能發揮激活下游基因轉錄的作用，使細胞順利通過S期[16]。當靜止期細胞重新進入增殖期時，E2F1/DP1正反饋調節下游細胞周期的關鍵基因cyclin E、cyclin A的轉錄，產生細胞進入S期所需的蛋白質。而這些周期蛋白只有與細胞周期蛋白依賴激酶(cyclin-dependent kinase，CDK)如CDK4/6、CDK2結合形成活性復合物才能發揮其功能，同時這些活性復合物的形成又依賴于雙特異性磷酸酶CDC25A對CDK的去磷酸化[17-19]。在G1晚期cyclin E/CDK2表達達到峰值，活性最強，啟動DNA的生物合成，促進細胞進入S期。并且有研究表明若E2F1轉錄因子活性降低可能會導致cyclin E和CDC25A的表達下調而使細胞增殖處于停滯狀態[20]。因此E2F1介導的增殖信號通路是啟動肝細胞增殖，加快細胞增殖進程的關鍵通路。逆挽方不僅能在基因水平上調LO2細胞E2F1 mRNA的表達， 而且各組細胞cyclin E、cyclin A、CDK2、CDC25A mRNA的表達也有所增加，另外在蛋白水平上也證實該方能上調DP1的表達。這些實驗結果均表明截斷逆挽方能通過刺激LO2細胞中E2F1的表達轉錄激活細胞增殖所需的各種因子，加快肝細胞從G1期向S期的轉換進程，促進細胞增殖。由此表明，通過介導E2F1增殖信號通路來促進肝細胞增殖，減輕D-GlaN誘導的LO2細胞損傷可能是截斷逆挽方保護肝細胞的關鍵機制之一。

截斷逆挽方是組方藥味多、成分復雜的復方，故其含藥血清于體外作用于D-GlaN誘導損傷LO2細胞，可作用于E2F1、cyclin E、cyclin A以及CDC25A等各個環節，極大促進肝細胞的增殖，保護肝功能，為臨床推廣使用該方提供理論依據。