蘆薈大黃素誘導斑馬魚肝毒性及作用機制研究

劉藝 王瑞昕 游龍泰 董曉旭

斑馬魚與人類基因同源性高達85%，擁有廣泛的細胞色素P450酶參與代謝反應，包括氧化、羥基化、接合、去甲基化和甲基化[1-3]，能體現Ⅰ相、Ⅱ相、腸菌及多途徑代謝的綜合結果。另具有飼養成本低、體外受精、透明易觀察、單次產卵數較高等特點[4-5]。目前斑馬魚已被美國國家衛生研究院列為繼人和鼠之后的第三大模式生物，可以快速篩選藥物和定量評價待測化合物的肝毒性作用。

大黃為蓼科植物掌葉大黃RheumpalmatumL.、唐古特大黃RheumtanguticumMaxim.ex Balf.或藥用大黃RheumoffcihaleBaill.的干燥根和根莖，具有瀉熱通腸、涼血解毒、逐瘀通經的功效[6-7]。然而, 近年有報道大黃中成分對機體的肝功能有不良影響，長期應用可能引起肝損傷，推測蘆薈大黃素可能為肝毒性成分之一[8-10]。另有研究表明蘆薈大黃素能明顯誘導動物肝細胞發生DNA損傷[11]，但蘆薈大黃素的體內致肝毒性作用機制尚未明確。因此，本研究中利用斑馬魚獨特的生理結構優勢，通過觀察不同濃度蘆薈大黃素處理后斑馬魚生存率，確定10%致死濃度(10% lethal concentration，LC10)與最大非致死濃度(maximum non-lethal concentration，MNLC)；進而研究斑馬魚肝臟形態、肝臟不透光度平均值，卵黃囊吸收延遲面積的影響。最后，對斑馬魚CYP450酶，凋亡相關蛋白等進行檢測，探討蘆薈大黃素致肝毒性的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

野生型AB品系斑馬魚，以自然成對交配繁殖方式進行。以上斑馬魚均飼養于28 ℃的養魚用水中(水質：每1 L反滲透水中加入200 mg速溶海鹽，電導率為480～510 μS/cm；pH為6.9～7.2；硬度為53.7～71.6 mg/L CaCO3)。飼養管理符合國際實驗室動物護理評估和認證協會(AAALAC)認證的要求。

1.2 實驗用藥、試劑與儀器

蘆薈大黃素購自上海詩丹德生物技術有限公司(批號：111573，純度>98.0%)；甲基纖維素購自Sigma(China)公司 (批號：9004-67-5) ；二甲基亞砜購自Sigma(China)公司 (批號：67-68-5)。Caspase3試劑盒(批號：0000273306)；Caspase9試劑盒(批號：0000271121)；CYP3A4試劑盒(批號：0000269999)均購自Promega公司。

解剖顯微鏡(SZX7，OLYMPUS，Japan)；與顯微鏡相連的相機(VertA1)；精密電子天平(CP214，奧豪斯)；6孔板(Fisher Scientific，China)；多功能酶標儀(LB940，Berthold Technologies，Germany)；96孔酶標板(Corning Incorporated，USA)。

1.3 蘆薈大黃素儲備液的制備

稱取適量蘆薈大黃素，用DMSO配制成一定濃度的藥物儲備液，-20℃保存，實驗前用養魚水稀釋，制備成的最終工作液中DMSO濃度不超過1%。

1.4 MNLC和LC10測定

隨機選取270尾受精后3天(3 dpf)野生型AB品系斑馬魚于六孔板中，每孔(實驗組)均放置30尾斑馬魚，水溶給予藥物濃度分別為100、200、300、400、600、800和1000 μM，同時設置正常對照組(養魚用水處理斑馬魚)和溶劑對照組(1% DMSO)。每天統計各實驗組的斑馬魚死亡數量并及時移除，處理48小時后，觀察記錄每個實驗組斑馬魚的死亡情況，計算其死亡率(%)，用OriginPro 8.0統計學軟件繪制最佳的“死亡率-濃度”效應曲線，計算蘆薈大黃素對斑馬魚肝臟毒性的MNLC和LC10。

1.5 斑馬魚肝臟毒性評價

隨機選取120尾受精后3天(3 dpf)野生型AB品系斑馬魚于6孔板中，實驗組每孔均放30尾斑馬魚，分別水溶給予藥物MNLC/3和MNLC濃度，同時設置正常對照組和溶劑對照組。用藥物處理斑馬魚48小時后，每個實驗(濃度)組隨機選取10尾斑馬魚在解剖顯微鏡下拍照，用NIS-Elements D 3.10高級圖像處理軟件進行圖像分析并采集數據，計算斑馬魚肝臟面積、肝臟不透光度平均值和卵黃囊吸收延遲面積。

1.6 斑馬魚細胞色素P450檢測

隨機選取120尾受精后3天(3 dpf)野生型AB品系斑馬魚于6孔板中，每孔(實驗組)均放30尾斑馬魚，分別水溶給予藥物MNLC/3和MNLC濃度，同時設置正常對照組和溶劑對照組。蘆薈大黃素處理斑馬魚48小時后，加入CYP試劑盒檢測CYP 3A4的活性，應用多功能酶標儀分析統計各實驗組斑馬魚相對發光單位(relative luminescence units，RLU)信號強度，進行定量分析。

1.7 斑馬魚凋亡蛋白檢測

隨機選取120尾受精后3天(3 dpf)野生型AB品系斑馬魚于6孔板中，實驗組每孔均放30尾斑馬魚，分別水溶給予供試品MNLC/3和MNLC濃度，同時設置正常對照組和溶劑對照組。藥物處理斑馬魚48小時后，用Caspase試劑盒檢測與凋亡相關的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶家族的Caspase3和Caspase9的活性，通過酶標儀檢測RLU信號強度，評價藥物各濃度對斑馬魚Caspase3和Caspase9活性的影響。

1.8 統計學處理

2 結果

2.1 蘆薈大黃素對斑馬魚的MNLC和LC10

蘆薈大黃素在300、400、600、800和1000 μM濃度條件下，分別誘發2/30、15/30、27/30、29/30和30/30尾斑馬魚死亡，死亡率分別為6.7%、50%、90%、96.7%和100%。藥物MNLC和LC10“死亡率-濃度”數據見表1。用OriginPro 8.0軟件擬合濃度-致死曲線(圖1)，經過曲線擬合，求得：蘆薈大黃素對斑馬魚的LC10為312 μM，MNLC為229 μM。在后續肝毒性評價實驗中，設置了1/3MNLC與MNLC為各給藥組。

2.2 蘆薈大黃素對斑馬魚肝臟毒性結果

與斑馬魚正常對照組(18631像素)相比，溶劑對照組的斑馬魚肝臟面積(18627像素)并未見顯著差異(P>0.05)，表明空白溶劑對斑馬魚肝臟面積無影響。與溶劑對照組相比，各給藥組(76.3 μM和229 μM)的斑馬魚肝臟面積分別為18204和18331像素，未見顯著差異(P>0.05)，表明蘆薈大黃素在該濃度內對斑馬魚肝臟面積無明顯影響。

表1 蘆薈大黃素對斑馬魚的MNLC和LC10

圖1 蘆薈大黃素對斑馬魚的致死率

與斑馬魚正常對照組相比，溶劑對照組斑馬魚肝臟不透光度平均值未見顯著差異，表明空白溶劑對斑馬魚肝臟變性無影響。與溶劑對照組相比，各給藥組(76.3 μM和229 μM)的斑馬魚肝臟不透光度平均值有顯著性差異(P<0.001)，表明蘆薈大黃素在該濃度內可誘發斑馬魚肝臟變性。

與斑馬魚正常對照組(2141)相比，溶劑對照組斑馬魚卵黃囊吸收延遲面積(1772像素)未見顯著差異，表明空白溶劑對斑馬魚卵黃囊吸收無影響。與溶劑對照組相比，各給藥組(76.3 μM和229 μM)的斑馬魚卵黃囊吸收延遲面積分別為14608和41478像素，有顯著性差異(P<0.05，P<0.001)，表明蘆薈大黃素在該濃度內可誘發斑馬魚卵黃囊吸收延遲(表2、圖2)。

表2 蘆薈大黃素對斑馬魚肝臟的影響

注：與溶劑對照組比較，aP< 0.05。

注：L:肝臟；Y:卵黃囊。

圖2斑馬魚暴露蘆薈大黃素后肝毒性的視覺表型

2.3 蘆薈大黃素對CYP450酶的影響

CYP450 3A4約占人體肝臟CYP450的30%～40%，有近50%的藥物通過它進行代謝[12]。結果顯示：溶劑對照組斑馬魚CYP3A4 RLU的活性(4006)與正常對照組(4251)比較，P>0.05，提示1% DMSO對斑馬魚細胞色素P450(CYP)活性無影響。MNLC/3濃度組斑馬魚CYP 3A4 RLU的活性為3100,MNLC濃度組斑馬魚CYP3A4 RLU的活性為2887,表明蘆薈大黃素對斑馬魚CYP 3A4有顯著的抑制作用。見表3。

表3 蘆薈大黃素對斑馬魚體內 CYP450 3A4活力的影響

注： 與溶劑對照組比較，aP<0.05。

2.4 蘆薈大黃素對斑馬魚凋亡蛋白的影響

蘆薈大黃素處理斑馬魚后，分別對各實驗組的斑馬魚體內的凋亡通路相關蛋白酶Caspase3和Caspase9的活性進行了檢測。結果顯示：溶劑對照組的斑馬魚Caspase3和Caspase9活性與正常對照組相比，P>0.05，說明空白溶劑對斑馬魚Caspase3和Caspase9無影響。另外，各給藥組(76.3 μM和229 μM)斑馬魚Caspase3和Caspase9活性均顯著高于溶劑對照組，且呈現明顯劑量依賴關系。表明蘆薈大黃素能上調Caspase9蛋白，引發級聯反應，導致Caspase3酶表達升高，誘導肝細胞凋亡。見表4、表5。

表4 蘆薈大黃素對斑馬魚體內 Caspase3蛋白的影響

注： 與溶劑對照組比較，aP<0.05。

表5 蘆薈大黃素對斑馬魚體內 Caspase9蛋白的影響

注： 與溶劑對照組比較，aP<0.05。

3 討論

斑馬魚因與人基因同源高、樣本量大、具有體外受精和胚胎透明、易于養殖和活體觀察、方便控制實驗條件和檢測等獨特優點，廣泛應用于疾病模型的建立和藥物篩選中[13]。關于斑馬魚在肝臟領域的研究報道逐漸增多，已經建立了酒精性脂肪肝、藥物性肝損害和肝癌模型[14-17]。張云等[18]研究了不同濃度對乙酰氨基酚對肝臟熒光轉基因斑馬魚幼魚的肝臟毒性，經對乙酰氨基酚處理后肝臟顏色變暗，卵黃囊腫，肝臟組織的 L-FABP 熒光表達下降，肝臟出現萎縮。 He等[19]用斑馬魚評價6種已知對人有肝毒性的藥物以及2種無肝毒性藥物的肝毒性，評價指標為：肝變性、肝腫大(萎縮)以及卵黃囊吸收延遲(意味著肝功能受到影響)。單盲法評價結果顯示，斑馬魚評價結果預測準確率為100%，組織病理學分析證實了斑馬魚表型觀察對藥物肝毒性預測的可靠性。目前，美國FDA和歐洲EMA已經接受用斑馬魚肝毒性評價數據進行藥物臨床申報。

本研究通過觀察不同濃度蘆薈大黃素(100～1000 μM)暴露后斑馬魚的一般情況，如生存率與表型等，發現隨著藥物濃度的升高和處理時間的延長，斑馬魚生存率顯著下降，呈現明顯劑量反應關系。肝臟毒性評價指標顯示，蘆薈大黃素(76.3 μM、229 μM)未明顯改變斑馬魚的肝臟面積，但隨著蘆薈大黃素濃度增大，斑馬魚的肝臟不透光度增加及卵黃囊吸收延遲面積增大。蘆薈大黃素對斑馬魚CYP 3A4酶有顯著的抑制作用，呈現明顯劑量—反應關系。ELISA結果表明，蘆薈大黃素(76.3 μM、229 μM)能顯著上調Caspase9蛋白水平，引發級聯反應，導致Caspase3酶表達升高，誘導斑馬魚肝細胞凋亡。

本實驗結果表明，蘆薈大黃素能誘導斑馬魚肝毒性發生，作用機制可能與蘆薈大黃素激活凋亡相關蛋白，誘導肝細胞凋亡，并且誘導斑馬魚Ⅰ相代謝酶的異常表達相關。