核桃青皮流浸膏對銀屑病小鼠皮膚屏障功能的影響及機制研究

馬婧怡 沈靜 張萬鑫 朱瑾 馬祖文

銀屑病俗稱牛皮癬，病因尚不明確，現代研究認為與遺傳、感染、免疫、精神、內分泌、外傷、飲食及代謝障礙等因素有關。有研究發現銀屑病患者往往具有表皮細胞增殖加速，角化不全和真皮淋巴細胞浸潤等變化，引起患者皮膚屏障功能受損，導致病情惡化。與皮膚屏障功能密切相關的物質主要包括水通道蛋白-3(aquaporin3, AQP3)、神經酰胺(ceramide , Cer)，絲聚合蛋白(filaggrin , FLG)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-14(caspase14)等。核桃屬(Juglansregia)植物已經具有兩千多年的栽培歷史，富含大量糖類、蛋白質、氨基酸、無機鹽、維生素、酚類、黃烷酮類和萘醌類等營養物質。核桃青皮(Walnutgreenhusk)是核桃殼外一層厚厚的綠色果皮，又叫青龍衣。核桃青皮既是珍貴的用材樹種，又是重要的藥源植物[1]。古代多篇文獻記載了其藥用價值：治水痢不止、病瘍、嵌甲[2]、銀屑病[3]、白癜風[4]、肝胃氣痛、胃神經痛、急慢性胃痛等。鑒于核桃青皮的主要功效，同時新疆盛產核桃，主要分布在和田阿克蘇等地，核桃青皮產量可觀，而日常生活中核桃青皮均被廢棄，因此本文主要分析銀屑病動物模型皮損處與皮膚屏障功能密切相關的基因表達變化，闡明核桃青皮對銀屑病小鼠皮膚屏障功能的影響及可能機制，為核桃青皮治療和預防銀屑病提供理論依據。

1 對象和方法

1.1 實驗動物

Balb/c鼠，普通級，體重18～20 g，雌雄各半，購自新疆醫科大學動物實驗中心。

1.2 實驗藥物

核桃青皮采自新疆維吾爾自治區和田地區墨玉縣扎瓦鄉依格孜艾日克村；咪喹莫特乳膏，購自四川明欣藥業有限責任公司；卡泊三醇軟膏，購自愛爾蘭利奧制藥有限公司，批號：A70108。

1.3 實驗儀器

顯微鏡E200(Nikon生物顯微鏡)；核酸蛋白定量儀K5500(北京凱奧)；電泳槽DYCZ-21(北京市六一儀器廠)；凝膠成像系統2500(上海天能)；MyCycler Thermal Cycler PCR儀(Bio-RadUSA)；ABI QuantStudioTM6 Flex Real-Time PCR Syste Real Time PCR instrument(ABI)。

1.4 核桃青皮浸膏的提取及流浸膏的制備

將核桃青皮干燥，粉碎成粉末，取100 g核桃青皮粉末，采用500 mL 95%乙醇回流的方法提取3次，每次3小時，抽濾，合并濾液，棄去濾渣，50℃減壓旋蒸，得濃縮液，將濃縮液置于60℃水浴鍋中干燥，得浸膏15 mL。準確稱取醇提浸膏60 mL用適當75%乙醇溶解，定溶于100 mL容量瓶中，配成60%流浸膏備用，同樣方法制成30%、15%流浸膏備用。

1.5 動物模型的制備、分組及給藥

1.5.1 動物模型的制備 Balb/c鼠背部脊柱兩側去毛，去毛面積約為3 cm×3 cm，適應性生長3天后進入實驗，使用5%咪喹莫特乳膏42 mg每日上午10:00涂于小鼠背部皮膚，1次/天，連續7天誘導銀屑病。

1.5.2 動物分組 Balb/c鼠72只，分為模型組、核桃青皮流浸膏低、中、高劑量組、陽性藥組以及假手術組，共6組，每組12只。除假手術組使用等量的凡士林涂抹，其余同模型制備。

1.5.3 動物給藥 模型組涂抹生理鹽水；核桃青皮流浸膏低劑量組涂抹15%核桃青皮流浸膏；核桃青皮流浸膏中劑量組涂抹30%核桃青皮流浸膏；核桃青皮流浸膏高劑量組涂抹60%核桃青皮流浸膏；陽性藥組涂抹卡泊三醇軟膏；假手術組涂抹生理鹽水。各組小鼠每日下午18:00涂抹適量的藥物，1次/天，連續10天。

1.6 檢測指標及方法

1.6.1 銀屑病評分 各組Balb/c鼠皮膚臨床癥狀采用銀屑病面積與嚴重程度指數(psoriasis area and severity index，PASI)評分標準，從紅斑、鱗屑、皮膚厚度3項指標進行評價，以0～4分進行記分，將3者積分相加得到總積分。PASI評分標準如下：0分，無癥狀；1分，輕度；2分，中度；3分，重度；4分，極重度。由兩名觀察者采取盲法的方式進行肉眼觀察，判斷評價，并采用數碼照相的方法進行記錄。

1.6.2 組織病理學檢查 頸椎脫臼處死小鼠后用眼科鑷取背部皮膚損傷處組織，用10%(質量分數)甲醛溶液固定，石蠟包埋，進行常規HE染色，分別于200倍及400倍顯微鏡下觀察皮膚組織病理變化。

1.6.3 RT-PCR檢測 各組Balb/c鼠皮膚組織中AQP3、Cer、FLG、Caspasel4的基因表達：頸椎脫臼處死小鼠后用眼科鑷取背部皮膚損傷處組織，皮膚組織置于研缽中液氮研磨后，參照TRLZOL試劑說明提取RNA，取800 ng RNA模板使用反轉錄試劑盒將RNA反轉錄為cDNA，以1 μL cDNA為模板，上下游引物各0.7 μL，引物信息見表1，將反應體系置于ABI Real Time PCR instrument儀器中進行PCR擴增，按照以下條件進行兩步法熒光定量PCR擴增：95℃預變性2分鐘；95℃變性5秒，60℃退火及延伸30秒，共40個循環。得到CT值，參照2-△△CT方法計算各基因mRNA相對表達量。

表1 熒光定量檢測引物信息表

1.7 統計學處理

2 結果

2.1 各組Balb/c鼠皮膚PASI評分

各組Balb/c鼠皮膚給藥10天后PASI評分見表2，其中模型組在給予咪喹莫特乳膏3天后出現明顯紅腫；4～5天受試皮膚出現明顯增厚及鱗屑，隨后皮膚損傷日益加重，直至第7天模型組Balb/c鼠受試皮膚出現結痂及白色斑塊狀鱗屑。陽性藥及各濃度治療組小鼠皮膚紅腫的出現時間、出現鱗屑的面積大小，皮膚增厚的程度均輕于模型組。至第10天，陽性藥及各濃度治療組小鼠皮膚紅腫程度輕、出現鱗屑的面積小，鱗屑少，皮膚增厚程度不明顯，整體較為光滑，見圖1。

表2 各組Balb/c鼠皮膚PASI評分

注： 與假手術組比較，aP<0.01。

注： A:模型組；B:核桃青皮流浸膏低劑量組；C:核桃青皮流浸膏中劑量組；D:核桃青皮流浸膏高劑量組；E:陽性藥組；F:假手術組。

圖1各組Balb/c鼠受試皮膚

2.2 各組Balb/c鼠皮膚組織的變化

HE染色結果顯示，模型組：鏡下表皮增厚伴角化過度及角化不全，棘層增厚，部分表皮突延長，真皮乳頭水腫伴血管擴張，血管周圍見少量淋巴細胞及中性白細胞浸潤，部分區域可見Munro微膿腫，部分區域可見表皮潰瘍形成。核桃青皮流浸膏低劑量組：鏡下表皮增厚伴角化過度，棘層增厚，真皮乳頭水腫伴血管擴張，血管周圍見少量淋巴細胞及中性白細胞浸潤，部分區域可見表皮潰瘍形成。核桃青皮流浸膏中劑量組：鏡下表皮增厚伴角化過度，棘層增厚，真皮乳頭水腫伴血管擴張，血管周圍見少量淋巴細胞及中性白細胞浸潤。核桃青皮流浸膏高劑量組：鏡下表皮輕度增生伴角化過度，棘層輕度增厚，真皮層輕微水腫，少量淋巴細胞及中性白細胞浸潤。陽性藥組：鏡下表皮輕度增生伴角化過度，棘層輕度增厚，真皮層輕微水腫，少量淋巴細胞浸潤。假手術組：鏡下表皮層菲薄，未見明確異常。見圖2。

2.3 各組Balb/c鼠皮膚組織中Cer、AQP3、Caspase14、FLG的基因表達

與假手術組相比，模型組、核桃青皮流浸膏低劑量組、中劑量組受試皮膚組織中的AQP3、Cer、FLG、Caspase14表達明顯下降(P<0.01)；與模型組相比，各組受試皮膚組織中的AQP3、Cer表達明顯升高(P<0.01)，核桃青皮流浸膏中劑量組、高劑量組、陽性藥組、假手術組FLG、Caspase14表達明顯升高(P<0.01)；與陽性藥相比，模型組、核桃青皮流浸膏低劑量組、中劑量組受試皮膚組織中的AQP3、Cer、FLG、Caspase14表達明顯下降(P<0.01)。見表3。

3 討論

古代多篇文獻記載了核桃青皮的藥用價值，但對它治療銀屑病的研究仍十分有限。AQP是哺乳動物細胞膜上與水的通透性相關的蛋白，起調節細胞內外水代謝的平衡作用，分十多種亞型，存在于人體皮膚的細胞膜上表達最多的一種水通道蛋白亞型是AQP3， 其主要作用是跨膜轉運水分、 甘油、尿素等物質以調節皮膚的水平衡，有保濕作用，參與皮膚水合作用，構成并調節皮膚屏障功能，保持正常皮膚的功能和形態，參與角質形成細胞的分化，有學者發現AQP3與濕疹、銀屑病等多種皮膚屏障功能相關的皮膚病發病機制相關[5]。Cer是人體皮膚角質層細胞間混合脂類物質的主要成分，對水分散發和外界刺激有防護作用，能夠滋潤皮膚、抗衰老、抗過敏，還有融合角質層蛋白質形成皮膚屏障的功能。有學者發現，神經酰胺的減少可引起皮膚功能異常，瘙癢類皮膚病患者的干燥皮損中神經酰胺的含量明顯低于正常皮膚[6]。FLG是表皮顆粒細胞角質透明蛋白顆粒的主要成分，有發現證實它的基因編碼突變會導致一些以皮膚干燥和皮膚屏障功能受損的疾病，如特應性皮炎(atopic dermatitis，AD)和尋常型魚鱗病、銀屑病[7]等。Caspase14不但可以促進表皮細胞終末分化，并且在角質層水合作用中發揮關鍵催化作用，以維持皮膚屏障的穩態，Caspase14的表達變化在皮膚老化及銀屑病等皮膚病中發揮重要的作用。

注：a:模型組(×200)；b: 模型組(×400)； c: 核桃青皮流浸膏低劑量組(×200)； d: 核桃青皮流浸膏低劑量組(×400)； e: 核桃青皮流浸膏中劑量組(×200)； f: 核桃青皮流浸膏中劑量組(×400)；g：核桃青皮流浸膏高劑量組(×200)；h：核桃青皮流浸膏高劑量組(×400)；i：陽性藥組(×200)；j：陽性藥組(×400)；k：假手術組(×200)；l：假手術組(×400)。

圖2各組Balb/c鼠皮膚組織的變化

表3 各組Balb/c鼠皮膚組織中AQP3、Cer、FLG、Caspase14的基因表達

注：與假手術組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.01；與陽性藥組比較，cP<0.01。

本實驗研究結果顯示：給藥10天后，陽性藥及各濃度核桃青皮流浸膏治療組較模型組皮損部位紅腫程度輕、鱗屑面積小，皮膚較光滑，增厚程度輕，尤其核桃青皮流浸膏高劑量組及陽性藥組較假手術組無顯著性差異(P>0.01)，證明有明顯的改善作用。通過皮膚組織病理學檢測可知，模型組鏡下表皮增厚伴角化過度及角化不全，棘層增厚，部分表皮突延長，真皮乳頭水腫伴血管擴張，血管周圍見少量淋巴細胞及中性白細胞浸潤，部分區域可見Munro微膿腫，部分區域可見表皮潰瘍形成，符合銀屑病的典型病理改變，不同濃度的核桃青皮流浸膏均可改變咪喹莫特乳膏致銀屑病模型的皮損狀況。與假手術組相比，模型組皮膚組織中的AQP3、Cer、FLG、Caspase14表達明顯下降(P<0.01)，表明AQP3、Cer、FLG、Caspase14參與銀屑病的病理改變，給予不同濃度的核桃青皮流浸膏后基因表達有不同程度的增強，表明核桃青皮流浸膏對咪喹莫特乳膏致銀屑病小鼠模型病理的變化有改善作用；核桃青皮流浸膏中、高劑量組AQP3、Cer、FLG、Caspase14表達分別與模型組比較均具有顯著性差異(P<0.01)，核桃青皮流浸膏低劑量組FLG、Caspase14的表達較模型組卻無顯著性差異(P>0.01)，且核桃青皮流浸膏高劑量組與陽性藥組相比，四種物質的表達均不具有顯著性差異(P>0.01)，這表明不同濃度核桃青皮流浸膏對受試皮膚損傷確實有改善作用，且與給藥量成線性關系，其中對AQP3、Cer表達的影響可能更為敏感。

綜上所述，核桃青皮流浸膏對咪喹莫特乳膏致銀屑病小鼠模型病理的變化有改善作用，其增強皮損組織中AQP3、Cer、FLG、Caspase14四種相關保濕因子的表達是改善皮膚損傷的可能機制之一，該結果為進一步探究核桃青皮治療銀屑病和預防復發提供了理論依據，是否還具有其他作用機制有待于進一步探究。