QuEChERS-HPLC-MS/MS法檢測谷物源性食品中3種赭曲霉毒素

林琳

江蘇康正生物科技有限公司（高郵 225600）

赭曲霉毒素是由赭色曲霉屬真菌產(chǎn)生的一種類真菌毒素，對人體具有肝毒性、腎毒性，有致癌、致畸、致突變的危害[1-3]。常見的赭曲霉毒素有赭曲霉毒素A（Ochratoxin A，OTA）、赭曲霉毒素B（Ochratoxin B，OTB）和赭曲霉毒素C（Ochratoxin C，OTC），其中以O(shè)TA毒性最大，化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1所示[4-6]。在自然條件下，污染的谷物糧食中一般都是幾種真菌毒素混合存在的狀態(tài)，而目前標(biāo)準(zhǔn)中主要是針對赭曲霉毒素A的檢測方法居多[7-9]。為了避免低估赭曲霉毒素的總攝入量和可能的不良反應(yīng)，必須考慮這3種毒素在人體內(nèi)累積所達到的毒性效果。所以建立一種針對谷源性食品中同時檢測3種赭曲霉毒素的檢測方法很有必要，對評價此類食品的安全具有重要意義。

目前對谷物源性食品中赭曲霉毒素的研究主要集中在OTA的分析檢測，有薄層色譜法、酶聯(lián)吸附免疫法、高效液相色譜法和高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[10-15]。薄層色譜法對檢測儀器及人員要求較低，但是此方法精度較差、試驗步驟冗長繁多[16-17]；酶聯(lián)免疫吸附法具有靈敏、快速等優(yōu)點，但是存在交叉污染反應(yīng)的缺點[18-19]；高效液相色譜法應(yīng)用較為廣泛，檢測穩(wěn)定性較好，但樣品中基質(zhì)易對赭曲霉毒素A產(chǎn)生干擾，前處理過程繁瑣，且采用的免疫親和柱成本較昂貴[20-22]。鑒于上述方法存在的不足，試驗運用QuEChERS技術(shù)的凈化特性，簡化提取過程，嘗試建立了QuEChERS凈化技術(shù)結(jié)合HPLC-MS/MS法檢測谷源性食品中3種赭曲霉毒素（OTA、OTB 和OTC）的方法，方法靈敏度高、重現(xiàn)性好，降低了檢測成本，可為谷物源性食品中赭曲霉毒素的分析和監(jiān)控提供技術(shù)支持。

圖1 OTA的化學(xué)結(jié)構(gòu)

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

2695型高效液相色譜儀（美國Waters公司）；API 3500 QTrap超高壓液相色譜-三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國AB公司）。

OTA溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（100 μ g/mL，lot：228012）、OTB溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（100 μ g/mL，lot：228034）、OTC溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（100 μg/mL，lot：228038）購于中國計量科學(xué)研究院。甲醇、乙腈（色譜純，德國Merck公司）；甲酸、乙酸（色譜純，上海安譜公司產(chǎn)品）。

1.2 樣品來源

樣品均為隨機購買于市場上銷售的谷物源性食品。

1.3 試驗方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Zorba-C18柱（2.1 mm×150 mm，3 μ m）。流速：0.3 mL/min。進樣量：20 μL。柱溫：30 ℃。流動相：A為0.10%甲酸溶液，B為乙腈。洗脫條件見表1。

表1 HPLC-MS/MS梯度洗脫條件

1.3.2 樣品的提取與凈化

稱取1.0 g混合鹽析劑置于10 mL離心管中，加入2.0 g樣品，加入4.0 mL提取溶液。取1 mL上清液于2.0 mL PE管中，加入凈化劑后渦旋10 s，離心取上清液，過膜后上機進樣分析。試驗分別比較不同的鹽析劑、提取溶液以及凈化劑組合對3種赭曲霉毒素檢測的影響。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

吸取10 μL的3種赭曲霉毒素的標(biāo)準(zhǔn)溶液，用甲醇定容到10.0 mL配制成100.0 ng/mL的中間液，再配制成1.0，2.0，5.0，10.0和50.0 ng/mL一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，經(jīng)儀器進行分析，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4 方法的精密度、重復(fù)性與回收率

以未檢出3種赭曲霉毒素的谷物源性運動食品為空白基質(zhì)，加入不同濃度的OTA、OTB、OTC混合標(biāo)液，使用QuEChERS提取后，上機檢測計算回收率。

2 結(jié)果與分析

2.1 QuEChERS前處理方法的優(yōu)化

2.1.1 鹽析劑的選擇

QuEChERS前處理試劑中的鹽析劑多采用氯化鈉、醋酸鈉、無水硫酸鎂、檸檬酸鈉、檸檬酸鈉二水合物和檸檬酸氫二鈉鹽倍半水合物等。Fernandes等[23]對大米中OTA檢測時，對QuEChERS作了較成熟的篩選試驗，采用了無水硫酸鎂、氯化鈉、檸檬酸鈉二水合物和檸檬酸氫二鈉鹽倍半水合物，質(zhì)量比為4︰1︰1︰0.5，提取效果良好，故試驗選擇了該比例混合試劑作為提取劑。

2.1.2 提取溶液的選擇

參考文獻[24-26]，赭曲霉毒素A的提取溶液一般采用的有甲醇-水、乙腈-水2種。試驗分別配制4種提取溶液：提取溶液Ⅰ，甲醇-水（80︰20，V/V）；提取溶液Ⅱ，甲醇-水（60︰40，V/V）；提取溶液Ⅲ，乙腈-水（80︰20，V/V）；提取溶液Ⅳ，乙腈-水（60︰40，V/V）。分別提取加標(biāo)樣品中的赭曲霉毒素，試驗結(jié)果以樣品中3種赭曲霉毒素的加標(biāo)回收率來比較提取溶液效果。

公元前230年至前221年，秦王嬴政先后滅韓、趙、魏、楚、燕、齊六國，成就了中華民族的偉大統(tǒng)一。秦王朝之所以能夠掃六合，平天下，始皇帝固然功不可沒，但我們更應(yīng)該注意到，這一時期的戰(zhàn)國在政治、經(jīng)濟、文化等方面本已趨于統(tǒng)一之勢，“秦特收其功”[1]，成為大一統(tǒng)時代的開創(chuàng)者，追根溯源，應(yīng)當(dāng)歸功于一百多年前商鞅變法的成功，商鞅變法建立起先進的政治經(jīng)濟制度，國力大增，使秦王朝統(tǒng)一六國成為歷史的必然。

如圖2所示，提取溶液Ⅲ的提取效果最優(yōu)，樣品加標(biāo)回收率最高，這可能與赭曲霉毒素的極性化合物性質(zhì)有關(guān)，在此比例的提取溶液條件下，目標(biāo)物在提取液中的分配系數(shù)高。且試驗中提取溶液Ⅲ與試樣比為2∶1（mL/g）時，加入鹽析劑樣品高速均質(zhì)后不易產(chǎn)生乳濁液，上層提取液易過濾分層，比較適合進行下步的試驗方案。

圖2 4種提取溶液對赭曲霉毒素回收率的影響

2.1.3 凈化劑的優(yōu)化

QuEChERS前處理技術(shù)常用的凈化劑有PSA、GCB、C18、NH2、中性氧化鋁、弗羅里硅土、SiO2。試驗考察了不同凈化劑以及不同添加量對回收率的影響。結(jié)果顯示，C18、NH2、弗羅里硅土和SiO2為較優(yōu)凈化劑，結(jié)果見圖3。

試驗還比較了SiO2+C18、NH2+C18和弗羅里硅土+C18共3種QuEChERS凈化劑組合，以提高目標(biāo)物的響應(yīng)值。

如圖4所示，30 mg SiO2+30 mg C18+150 mg MgSO4和30 mg弗羅里硅土+30 mg C18+150 mg MgSO4兩組對OTA、OTB、OTC響應(yīng)值較高，前者的平均回收率更高，所以試驗選擇了30 mg SiO2+30 mg C18+150 mg MgSO4組合作為凈化劑。

圖3 3種赭曲霉毒素經(jīng)不同凈化劑處理后的回收率比較

圖4 3種赭曲霉毒素經(jīng)不同凈化劑組合處理后的回收率

2.2 流動相的選擇

赭曲霉毒素屬于極性化合物，因此流動相以水和乙腈作為基礎(chǔ)溶劑。為了促進樣品的離子化，試驗比較了流動相中加入0.1%甲酸、0.1%乙酸和10 mmol/L乙酸銨對3種赭曲霉毒素分離效果的影響。結(jié)果表明，加入甲酸時的離子豐度最強，因此最終確定在流動相中添加0.1%甲酸進行梯度洗脫。標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖見圖5。

圖5 赭曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)色譜圖

2.3 質(zhì)譜條件的選擇

用質(zhì)量濃度為50 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，對目標(biāo)物進行一級和二級質(zhì)譜掃描，并優(yōu)化質(zhì)譜參數(shù)。依據(jù)目標(biāo)物的分子式和碎片離子信息擬合出理論精確質(zhì)量數(shù)。3種化合物的質(zhì)譜分析參數(shù)見表2。

2.4 方法的線性范圍與靈敏度

在乙腈-0.1%甲酸流動相體系中，以表1梯度洗脫的步驟，按1.3.3試驗步驟配制3種赭曲霉毒素的標(biāo)準(zhǔn)溶液，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明：3種赭曲霉毒素在1.0～50.0 ng/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)均具有良好的線性關(guān)系，結(jié)果見表3。

表2 3種赭曲霉毒素的多反應(yīng)監(jiān)測掃描模式的質(zhì)譜參數(shù)

表3 3種赭曲霉毒素的保留時間、標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)、檢出限與定量限

2.5 方法的精密度、重復(fù)性與回收率

表4 方法的回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=5）

在加標(biāo)回收試驗中，選用面粉基質(zhì)、米粉基質(zhì)、燕麥基質(zhì)、玉米基質(zhì)4種空白基質(zhì)的樣品，分別添加1倍限量、2倍限量和10倍限量低、中、高的三個水平混合標(biāo)準(zhǔn)品，每個結(jié)果測定5次，進行加標(biāo)回收的試驗。

由表4可見，在4種不同的谷源性基質(zhì)樣品中，3種赭曲霉毒素（OTA、OTB、OTC）的回收率為84.6%～107%，精密度為2.15%～5.67%，說明試驗的檢測數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確度和精密度可行。

3 結(jié)論

試驗建立了一種QuEChERS-HPLC-MS/MS檢測谷物源性食品中3種赭曲霉毒素的分析方法。結(jié)果表明，樣品經(jīng)乙腈-水（80︰20，V/V）進行提取后，經(jīng)30 mg SiO2+30 mg C18+150 mg MgSO4組合凈化劑處理后，可有效去除谷物源性食品中的干擾物對目標(biāo)峰的影響，實現(xiàn)對3種赭曲霉毒素的凈化，在質(zhì)譜檢測器的多反應(yīng)監(jiān)測模式下，可實現(xiàn)同時對谷物源性食品中OTA、OTB和OTC三種赭曲霉毒素的定性和定量分析。在4種谷源性樣品基質(zhì)中，加標(biāo)回收率為84.6%～107%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）在2.15%～5.67%之間，所建立的方法具有可靠的準(zhǔn)確度和精密度，能準(zhǔn)確快速有效地檢測谷物源性食品中的3種赭曲霉毒素的含量，可為谷物源性食品中OTA、OTB和OTC的分析和監(jiān)控提供技術(shù)支持。