UPLC-MS/MS測定普洱茶中黃曲霉毒素B1，B2，G1和G2

陳曉嘉 ，周芳梅 ，鐘舒潔 ，李志龍 ，馮志強

1. 廣東省食品質量監督檢驗站（廣州 510308）；2. 廣東省食品工業研究所有限公司（廣州 510308）；3. 廣東省食品工業公共實驗室（廣州 510308）

黃曲霉毒素由真菌黃曲霉和寄生曲霉產生，主要有4種：AFTB1，AFTB2，AFTG1和，是自然界已發現的理化性質最穩定的真菌毒素，有很強的毒性、致癌性和致畸毒性[3]。1993年，世界衛生組織將黃曲霉毒素劃定為Ⅰ類致癌物質[4]。中國是茶葉生產、出口和消費大國，茶葉安全問題深受社會關注，近年來更是流傳“普洱茶致癌說”，安全問題已演變為普洱茶生產、流通領域的重大挑戰。目前黃曲霉毒素檢測方法主要有酶聯免疫吸附法[5-6]、薄層色譜法[7]、高效液相色譜（FLD）[8]、液相色譜質譜串聯法[9]。ELISA、HPLC法檢測普洱茶中四種黃曲霉毒素均存在假陽性，GB 5009.22—2016中液相色譜質譜串聯法適用基質不包含茶葉類別。

試驗采用免疫親和柱進行凈化處理，UPLC-MS/MS法測定普洱茶中AFTB1，AFTB2，AFTG1和AFTG2的含量。

1 材料與方法

1.1 儀器

Triple Quad 3500超高液相質譜聯用儀（美國AB SCIEX公司）；Turbo Vap LV 50位自動氮吹濃縮儀（瑞典Biotage公司）；AG204電子分析天平（瑞士Mettler Toledo）；KQ-500DE超聲波清洗儀（昆山牌）；CF15 RXII高速冷凍落地式離心機（日立）；特異性免疫親和柱（美國Romer Labs公司）。

1.2 材料與試劑

黃曲霉毒素混標（純度98%，美國O2SI公司，ATFB1，ATFB2，ATFG1和ATFG2濃度分別為0.999 6，0.300 2，0.999 6和0.305 5 mg/L）。

乙腈（色譜純，默克）；氯化鈉（分析純，廣州化學試劑廠）；十二水磷酸氫二鈉（分析純，天津市化學試劑一廠）；磷酸二氫鉀（分析純，廣州化學試劑廠）；氯化鉀（分析純，廣州化學試劑廠）；吐溫-20（分析純，阿法埃莎（天津）化學有限公司）；甲醇（分析純，天津市化學試劑一廠）。

1.3 色譜條件

Waters ACQUITY UPLC BEH C18液相色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μ m），流動相為0.1%甲酸乙腈+0.1%甲酸水，梯度洗脫，見表1；流速0.5 mL/min；進樣量10.0 μL；柱溫40 ℃。

表1 黃曲霉毒素流動相洗脫梯度

1.4 質譜條件

電噴霧離子源（ESI+），正離子掃描方式，多反應監測模式（MRM），電噴霧電壓為5 500 V，離子源溫度為550 ℃，氣簾氣（CUR）壓力為38 psi，霧化器壓力（GAS1）為55 psi，輔助加熱器壓力（GAS2）為60 psi。黃曲霉毒素AFTB1，AFTB2，AFTG1和AFTG2的其他相關質譜參數如表2所示。

表2 黃曲霉毒素目標物選擇反應檢測優化參數

1.5 標準物質溶液配制

準確移取1.0 mL混標溶液于100 mL容量瓶中，加50%甲醇水稀釋配制成儲備液（AFTB1和AFTG1的質量濃度為10 ng/mL，AFTB2和AFTG2的質量濃度為3 ng/mL），精確移取0.01，0.05，0.1，0.2，0.5和0.8 mL儲備液于1.0 mL容量瓶中，用50%甲醇水稀釋定容，作為標準曲線溶液（其中0.01 mL僅含AFTB1和AFTG1），AFTB1和AFTG1曲線質量濃度為0.1，0.5，1，2，5和8 ng/mL，AFTB2和AFTG2曲線質量濃度為0.15，0.3，0.6，1.5和2.4 ng/mL。

1.6 樣品處理

1.6.1 樣品制備

取500 g普洱茶樣品，經高速粉碎機磨細后過20目篩備測，取5.0 g待測樣品加入25 mL 70%甲醇水溶液進行提取，超聲30 min，以10 000 r/min離心5 min。取2 mL上清液，加入12 mL吐溫溶液，旋渦1 min，待測。

1.6.2 樣品凈化

樣品待測液以1 mL/min流速全部通過特異性免疫親和柱，先用5 mL PBS溶液和5 mL水以1 mL/min流速淋洗親和柱去掉雜質，再用2 mL甲醇洗脫，抽干親和柱，收集全部洗脫液至試管中，在50 ℃下用氮氣將洗脫液吹至近干，用50%甲醇水定容至1.0 mL，旋渦1 min復溶，用微孔過濾膜（0.2 μ m）壓濾后進樣上機。

2 結果與討論

2.1 樣品提取液的優化

對于茶葉的前處理，首先要加提取液進行浸泡超聲提取毒素，黃曲霉毒素極性大，試驗提取液體系選擇了以甲醇-水（體積比為30︰70，50︰50和70︰30）和乙腈-水（體積比為30︰70，50︰50和70︰30）為提取劑對樣品進行提取，檢測含量，計算回收率，回收率結果見圖1。結果表明，甲醇-水（體積比70︰30）和乙腈-水（體積比70︰30）的提取效率最高，回收率均在80.3%以上。乙腈毒性較大，故試驗選擇了甲醇-水（體積比70︰30）作為提取劑。

圖1 不同提取液體系回收率

2.2 樣品凈化的優化

試驗同時選用了多功能凈化柱與免疫親和柱對凈化效果做比對，使用多功能凈化柱進行凈化測定普洱茶中的4種黃曲霉毒素的加標回收率在101%～135%之間，使用免疫親和柱進行凈化測定普洱茶中的黃曲霉毒素的加標回收率在80.3%～116%之間。經多功能凈化柱凈化后的樣品仍有明顯的基質干擾，凈化效果不理想，導致含量偏高。多功能凈化柱操作方便快捷，但不如免疫親和柱的特異性顯著，能有效吸附雜質；多功能凈化柱適用于簡單基質的樣品，對于茶葉這種基質復雜的樣品，免疫親和柱更為適用。

2.3 色譜條件的優化

試驗選擇了Waters ACQUITY UPLC BEH C18液相色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）為分離柱，在正離子模式下，流動相中加入0.1%甲酸水溶液，有利于化合物的離子化。大多數真菌毒素易溶于甲醇和乙腈等有機試劑。流動相分別選擇甲醇和乙腈做比對。結果證明，選擇甲醇作流動相時，色譜分離效果比乙腈好，但是離子化程度受抑制，離子響應值下降，靈敏度較低；乙腈的離子化程度高于甲醇，離子響應值較高，靈敏度增高，因此采用0.1%甲酸乙腈+0.1%甲酸水作為流動相。經過優化，確定了流動相比例和梯度條件，優化后的流動相洗脫梯度見表1。

2.4 質譜條件優化

試驗以0.1%甲酸乙腈+0.1%甲酸水作為流動相，對4種黃曲霉毒素進行質譜條件的優化，選用MRM多反應監測模式檢測4種黃曲霉毒素，4種黃曲霉毒素在正離子模式下獲得[M+H]+的響應值最大，通過母離子掃描模式，確定母離子去簇電壓最優參數，再通過子離子模式，進一步優化碰撞電壓，選擇響應最佳的子離子用于定量，優化后的MRM條件見表2。

2.5 質譜結果

圖2 4種黃曲霉毒素的MRM離子圖

取標樣溶液（含80 ng/mL AFTB1和AFTG1，24 ng/mL AFTB2和AFTG2）上機分析，AFTB1，AFTB2，AFTG1和AFTG2的 MRM離子圖如圖2所示。

2.6 線性關系、檢測限和定量限

以待測黃曲霉毒素定量離子色譜峰面積為縱坐標，黃曲霉毒素濃度為橫坐標，進行線性關系考察。黃曲霉毒素B1和G1在0.1～8 ng/mL質量濃度范圍內呈良好線性關系，相關系數為0.999 4～0.999 6；黃曲霉毒素B2和G2在0.15～2.4 ng/mL質量濃度范圍內呈良好線性關系，相關系數為0.999 0～0.999 1，具體見表3。

取陰性樣品，加入標液，同樣品處理方法制備、測定，以3倍信噪比確定檢出限（LOD），以10倍信噪比計算方法確定定量限（LOQ）。黃曲霉毒素B1，B2，G1和G2的檢出限（LOD）均為0.25 μg/kg，定量限（LOQ）分別為0.60，0.60，0.60和0.80 μg/kg，具體見表3。

2.7 精密度

取陰性樣品，加入適當的稀釋混合儲備液，最終含量分別為：AFTB1和AFTG150 μg/kg；AFTB2和AFTG215 μg/kg。樣品處理方法平行制備6份，進行4種黃曲霉毒素精密度測試。黃曲霉毒素B1，B2，G1和G2的RSD（n=6）分別為2.7%，3.4%，2.4%和3.6%，具體見表3。

表3 4種黃曲霉毒素線性關系、檢測限、定量限和重復性

2.8 方法回收率

取陰性樣品，分別加入適量的混合標準溶液，最終加標含量成低、中、高3個濃度，每個濃度各測6次。分別在5 g樣品中加入適量的混合標液，使AFTB1和AFTG1含量分別為0.25，5和20 ng/g，AFTB2和AFTG2含量分別為0.75，1.5和6 ng/g，同樣品處理方法制備，檢測含量，其回收率為80.3%～116.7%，相對標準偏差≤5.2%，具體見表4。

2.9 檢測方法的對比和分析

目前檢驗黃曲霉毒素的常用檢測方法主要有酶聯免疫吸附法（ELISA）、薄層色譜法（TLC）、免疫親和柱凈化-柱后衍生化-高效液相色譜-熒光檢測方法。試驗選用酶聯免疫吸附法（ELISA）、免疫親和柱凈化-柱后衍生化-高效液相色譜-熒光檢測方法（HPLC-FLD）與所建立的超高效液相色譜-串聯三重四級桿質譜法（UPLC-MS/MS）三種方法對普洱茶中4種黃曲霉毒素進行方法比對檢測，方法比對結果見表5。ELISA法與HPLC-FLD法檢測普洱茶中的黃曲霉毒素B1，B2，G1和G2含量均出現假陽性結果。由于茶葉含有酚類物質，故不適用于ELISA法檢測黃曲霉毒素。HPLC-FLD方法主要用分析物的保留時間作定性依據，茶葉基質復雜，基質中的組分與分析物極性相似，導致保留時間相似，故有誤判，因此HPLCFLD方法不適用于檢測普洱茶中的4種黃曲霉毒素。

UPLC-MS/MS方法采用分析物的保留時間和離子對作為定性依據，不存在誤判。因此在分析物定性方面，UPLC-MS/MS方法優于HPLC-FLD方法，樣品經過特異性免疫親和柱后，在MRM多反應監測模式下，可有效屏蔽茶葉的復雜基質，實現對目標物質的凈化，能準確、快速地檢測茶葉中的4種黃曲霉毒素含量，有效地避免假陽性或者假陰性結果的出現。免疫親和凈化-超高效液相色譜串聯質譜法具有快速、準確、靈敏等特點，有助于提高分析效率，降低成本，為茶葉中4種黃曲霉毒素含量的測定提供參考。

表4 4種黃曲霉毒素回收率和重復性

表5 三種檢測方法結果對比

3 結論

試驗建立了超高效液相色譜-串聯三重四級桿質譜法測定普洱茶中黃曲霉毒素B1，B2，G1和G2的方法。普洱茶樣品經甲醇-水（70︰30，V/V）提取后，采用免疫親和柱凈化樣品提取液，減少樣品雜質的干擾。試驗分別對樣品前處理方法、色譜條件、質譜條件進行了比較和優化，所建立的方法操作簡單，回收率和精密度高，靈敏度高，解決了原有方法測定普洱茶中黃曲霉毒素假陽性的問題。該方法適用于普洱茶中黃曲霉毒素B1，B2，G1和G2的檢測。