高效液相色譜法測定花蛤中撲草凈殘留量

田亞亞，劉敏軒，楊茜，亢春雨，王向紅*

河北農業大學食品科技學院（保定 071000）

撲草凈是一種抑制植物光合作用的選擇性內吸收傳導型的含氮除草劑，用于田地的除草效果很好[1]，卻被一些不法商家用于水產養殖行業，用來清除養殖水體中的水草及有害藻類，導致撲草凈在水產品中累積殘留，如魚、蝦、貝、蟹、海參等水產品，最終可能通過食物鏈直接損害人類健康[2-3]。

圖1 撲草凈的結構式

目前，中國對蔬菜、水果、糧食中撲草凈殘留的測定方法有明確的國家標準，且對水、土壤中撲草凈的測定方法報道較多，但對水產品中撲草凈殘留檢測研究得比較少，故中國尚無相對完善的檢測水產品中撲草凈殘留量的標準方法。因此，建立水產品中撲草凈殘留量的快速檢測技術迫在眉睫。食品（主要為植物性食品）中撲草凈殘留量的檢測方法有氣相色譜法（FID檢測器）[4]、氣相色譜-質譜法[5]、液相色譜法[6-7]、液相色譜-串聯質譜法[8]，其中分析水產貝類中的撲草凈殘留量的檢測方法有液相色譜-串聯質譜法[9]。

試驗采用高效液相色譜法測定水產品——花蛤中撲草凈的殘留量。該方法操作簡便、快速靈敏、準確可靠。

1 材料與方法

1.1 主要儀器

Waters 1525高效液相色譜儀；SunFireTMC18柱（4.6 mm×150 mm×5 μ m）；RE-52 A型旋轉蒸發儀（西安安泰儀器有限公司）；KQ-500 DE數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；HJ-2 B恒溫磁力攪拌器（金壇市醫療儀器廠）；十萬分之一電子天平（托利多上海有限公司）；燒杯；量筒；漏斗；容量瓶。

1.2 試劑

撲草凈（國家標準物質研究中心研制，純度99.9%）；70%甲醇、純甲醇（色譜純，邁瑞達公司）；二氯甲烷（分析純，天津市進豐化工有限公司）；正己烷（色譜純，天津市福晨化學試劑廠）；氯化鈉（國藥集團化學試劑有限公司）；無水硫酸鈉（化學純，天津市天力化學試劑有限公司）；C18小柱（500 mg/3 mL）；氨基小柱（500 mg/3 mL）；石墨化碳黑小柱（500 mg/3 mL）；氧化鋁（酸性）小柱（500 mg/3 mL）；PSA小柱（N-丙基乙二氨鍵合硅膠固相萃取小柱，500 mg/3 mL）。

1.3 色譜條件

色譜柱，SunFireTMC18柱（4.6 mm×150 mm×5 μ m）；流動相，甲醇-水（70︰30，V/V）；紫外波長230 nm；流速1 mL/min；柱溫25 ℃；進樣體積10 μL。

1.4 溶液配制

1.4.1 標準儲備液的配制

準確稱取50 mg撲草凈標準品至50 mL容量瓶中，用甲醇定容，制得1.0 mg/mL標準貯備液。

1.4.2 供試品溶液的配制（樣品前處理）

提?。悍Q取10 g已粉碎均質的樣品于燒杯中，每次加入30 mL丙酮，于振蕩器上振蕩10 min，靜置分層后，收集濾液于錐形瓶中，重復3次。在濾液中加入5 g氯化鈉，振蕩15 min，靜置分層，棄去水層，丙酮層過無水硫酸鈉后，收集于燒杯中，用10 mL的丙酮洗滌錐形瓶，過濾到燒杯中，用氮吹濃縮儀于50 ℃濃縮至干，加3 mL丙酮溶解殘渣。

凈化：取固相萃取小柱，加入1柱管體積的正己烷對小柱活化。加入3 mL的樣品處理液，并用2 mL×2的丙酮洗滌雞心瓶，并將洗滌液轉移到小柱中。用2 mL×2的二氯甲烷洗脫，收集洗脫液。

濃縮：收集洗脫液于燒杯中，用氮吹濃縮儀于40℃濃縮至干，用1 mL的甲醇定容。過0.22 μm有機濾膜，供液相分析。

2 結果與討論

2.1 流動相配比的選擇

考察甲醇-水90︰10，80︰20和70︰30（V/V）3種配比的混合溶液為流動相，其他色譜條件相同。結果發現，當流動相為甲醇-水90︰10時，撲草凈保留時間為2.67 min，出峰時間太早，易受到其他雜質的干擾。當甲醇-水80︰20時，保留時間為4.08 min，分離效果不明顯，峰形不好。當甲醇-水70︰30時，保留時間為7.94 min，分離效果、洗脫效果都很好，且色譜峰形好。故選擇甲醇-水70︰30（V/V）作為流動相。撲草凈標樣液相色譜圖見圖2。

圖2 撲草凈標準溶液的液相色譜圖

2.2 萃取條件的選擇

2.2.1 固相萃取小柱的選擇

花蛤中含有大量的蛋白、脂肪、碳水化合物等營養物質，這些物質會對試驗結果產生較大影響，故在進行液相分析前需有效地去除這些雜質[10]。固相萃取作為最常用的樣品凈化方法之一，可滿足液相對樣品前處理的要求。試驗選用PSA柱（N-丙基乙二氨鍵合硅膠固相萃取小柱）、C18柱、石墨化碳黑柱、氨基柱、氧化鋁（酸性）柱5種不同固相萃取小柱進行試驗。

以花蛤為樣品，在撲草凈添加濃度0.05 mg/kg條件下，比較不同固相萃取小柱的萃取效果。由圖3可以看出，經PSA固相萃取小柱萃取后，得到的峰面積最大，說明PSA小柱中的吸附劑N-丙基乙二氨對撲草凈的吸附能力很強。同時由表1中不同萃取小柱對回收率的影響也能得出由PSA小柱處理后得到的回收率為86.54%～89.21%，是5種不同萃取小柱中得到回收率最高的。PSA柱屬于弱陰離子交換柱，吸附機制之一為極性作用和螯合作用[11]，故能很好地將撲草凈吸附在表面。操作方法較為簡單，能達到較好的凈化效果，故選擇PSA固相萃取小柱作為固相萃取的凈化柱。

圖3 不同固相萃取小柱對峰面積的影響

表1 不同固相萃取小柱對回收率的影響（N=6）

2.2.2 洗脫劑的選擇

試驗比較丙酮、甲醇、正己烷、二氯甲烷和乙腈對撲草凈的洗脫效果。撲草凈添加濃度0.05 mg/kg，使用PSA柱為萃取柱條件下，經萃取后，分別以這5種溶劑進行洗脫，測定洗脫液的峰面積。從圖4可以看出，正己烷的洗脫效果最好。由表2同樣可以得出，經正己烷洗脫后，回收率最高達94.58%，洗脫劑采用甲醇、乙腈時，回收率均小于60%。洗脫劑采用正己烷溶液時，由于其極性大于提取液，可將結合在PSA柱上的撲草凈直接洗脫，操作簡單，凈化效果好。

圖4 不同洗脫劑對峰面積的影響

表2 不同洗脫劑對回收率的影響（N=6）

圖5 空白花蛤樣品的液相色譜圖

圖6 加標花蛤樣品的液相色譜圖

2.3 方法學驗證

2.3.1 線性關系

用甲醇稀釋配置撲草凈含量分別為1，10，40，80，100，200，600和1 000 μg/mL的標準溶液，進行測定。以標準樣品的質量濃度（x）為橫坐標，相應的峰面積（y）為縱坐標繪制標準曲線。得撲草凈的標準曲線回歸方程：y=6.3×104x+1.46×106，相關系數為R2=0.996 1。

圖7 撲草凈的標準曲線

2.3.2 回收率、精密度與檢出限

由表3可以得出，在0.025～0.100 mg/kg范圍內，撲草凈回收率為76.13%～85.57%；相對標準偏差（N=6）為2.45%～7.74%。以基線噪聲3倍峰面積對應的質量濃度確定撲草凈的檢出限，得出撲草凈檢出限為0.3 μg/kg。

表3 花蛤樣品中撲草凈的添加回收率與精密度（N=6）

3 結論

建立一種采用高效液相色譜法測定水產品——花蛤中撲草凈殘留量的分析方法。該方法對樣品的前處理較為簡單且凈化結果良好，故可推廣使用。結果表明，該方法的檢出限為0.3 μg/kg，在0.025～0.100 mg/kg濃度范圍內，撲草凈回收率最高可達85.57%；相對標準偏差均小于10%。靈敏度、準確度、精密度、穩定性、方法的回收率均能滿足農藥殘留分析要求，故可保證檢測分析數據的可靠性，是一種較為理想的快速檢測方法。