陳年白茶香氣成分分析方法的優化及應用

寧芊，韋航，陳美卿，方靈，史夢竹，傅建煒*

1. 福建農林大學金山學院（福州 350002）；2. 福建省農業科學院農業質量標準與檢測技術研究所/福建省農產品質量安全重點實驗室（福州 350002）

中國是茶的故鄉，茶葉作為一種具有資源優勢、保健功效、文化底蘊和消費傳統的特色農產品，深受全球消費者的歡迎[1]。茶葉中的芳香物質是指茶葉中發揮物質的總稱，茶葉中香氣成分的含量雖然都很少，一般只占干物質的0.01%～0.05%，但其種類卻非常復雜且對形成茶香起到重要作用[2]，是決定茶葉品質的決定性因素。據分析，通常茶葉含有的香氣成分化合物達到300余種，鮮葉中香氣成分的化合物有50種。

不同年份的茶葉，其主要成分會發生改變，其中香氣成分也有所變化。一般當茶葉存放超過2年，茶的香氣基本散失殆盡。但白茶卻不同，白茶主產于福建，為中國特有的茶類。經過萎凋和干燥后，造就成茶外表滿披白毫，湯色清淡且淺黃明亮，滋味鮮醇或清甜，且伴有毫香的獨特品質特征。與其他茶葉相比，白茶存放時間越長，其藥用價值越高，有“一年茶，三年藥，七年寶”的說法[3-4]。隨著貯藏年份增加，當年新白茶獨有“毫香蜜韻”呈杏花香，存放3～8年后則呈荷葉香，8～15年轉為棗香，15年以上則呈琥珀沉香。

采用現代儀器分析手段詳細研究福建白茶的特征香氣物質，識別出主要香氣特征化合物，研究不同等級和不同年份的白茶香氣物質的共同點和區別之處，對于豐富茶葉的香氣分析技術，完善茶葉香氣化學理論，對改善和提高茶葉的香氣品質等均具有重要意義[5]。祁丹丹等[6]利用氣相色譜-串聯質譜結合化學計量學分析快速陳化和自然陳化白茶香氣上的差異，劉琳燕等[7]、王力等[8]采用頂空固相微萃取后，經GC-MS鑒定不同年份白茶的香氣成分，結果表明：頂空固相微萃取的結果在眾多茶葉揮發性化合物測定中與感官審評的結果最為接近，但是它對萃取溫度和萃取時間的依賴性很大。但目前對于白茶香氣物質檢測條件的優化研究，尚鮮見報道。

試驗通過調整不同的檢測條件，得到最優頂空固相微萃取-氣相串聯質譜（HS-SMPE-GC-MS/MS）檢測方法，并應用于檢測不同年份不同等級福建白茶的香氣物質之間的區別，旨在提高白茶香氣檢測的精準度及陳年白茶香氣組成研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

不同年份的白茶：2014年一級牡丹、2015年一級牡丹、2016年一級牡丹、2007年高級牡丹、2012年高級牡丹、2007年特級牡丹、2017年特級牡丹。

1.2 儀器與設備

島津GCMS-TQ8040氣相色譜-三重四級桿質譜儀；固相微萃取裝置，SPME手動進樣手柄（上海安譜科學儀器有限公司）和萃取頭（50/30 μm DVB/CAR/PDMS）；恒溫水浴鍋（朗越SYG-2，常州朗越儀器）；鐵架臺（揚州美家臣連教儀器廠）；40 mL透明頂空萃取瓶（Agilent RAISE）；40 mL樣品瓶白色開口蓋（RAISE）；含本色PTFE/本色硅膠墊；分析天平（AB204-5）。

1.3 試驗方法

1.3.1 萃取頭的老化

將固相萃取頭在氣相色譜進樣口250 ℃老化20 min，除去可能殘留在萃取頭的吸附物。GC-MS進樣檢測，檢測萃取頭沒有吸附茶葉香氣的本底值，驗證萃取頭是否老化完全。

1.3.2 檢測的條件優化

1.3.2.1 水浴吸附溫度的優化

保持其他檢測條件不變，在不同水浴吸附溫度（30，50，70和90 ℃）下考察茶葉香氣的物質檢測情況，對比其出峰的數量和峰面積大小。

1.3.2.2 水浴吸附時間的優化

保持其他檢測條件不變，在不同水浴吸附時間（15，30，45，60和90 min）下考察茶葉香氣的物質檢測情況，比較其出峰的數量和面積大小。

1.3.2.3 GC-MS升溫程序的優化

保持其他檢測條件不變，在不同氣相升溫程序下茶葉香氣的物質檢測情況，對比其色譜峰分離程度和峰面積大小。

1.3.2.4 GC-MS氣相色譜條件進樣優化

保持其他檢測條件不變，在不同的進樣方式下（不分流、分流）及不同分流比進樣的條件下考察茶葉香氣的物質檢測情況，對比其色譜峰分離程度和峰面積大小。

1.3.3 茶葉香氣萃取試驗方法

試驗前將固相微萃取頭置于氣相色譜儀進樣口，經270 ℃老化15～20 min備用，稱取3 g干茶樣于40 mL頂空萃取瓶中，加蓋密封。于恒溫水浴鍋中恒溫水浴一定時間，使其達到氣-液平衡。將老化好的萃取頭插入樣品瓶頂空部分，萃取一定時間，將萃取頭取出，插入氣質聯用儀進樣口，立即對所富集的香氣進行3 min解析，然后運氣GC-MS進行香氣物質檢測。

2 結果與分析

2.1 水浴萃取溫度的優化

香氣物質進入固定相的平衡時間與萃取的溫度選擇有關系，因此應選擇適當的萃取溫度條件，使其在合理的時間范圍、GC-MS檢測條件下能獲得滿意的靈敏。萃取溫度分別為30，50，70和90 ℃時，香氣成分的出峰情況如圖1（a）～（d）所示。30 ℃時茶葉香氣出峰的數量和峰面積比較小，隨著萃取溫度逐漸升高，茶葉香氣的出峰數量明顯增加，峰面積也有所變化，10～18 min的峰面積隨著溫度升高而逐漸減小，18～43 min的峰面積隨著溫度升高而逐漸增大，90 ℃條件下，10～25 min的峰有所減少，并且重復性差，不穩定，綜合考慮選擇70 ℃水浴進行檢測。

圖1 不同水浴吸附溫度下茶葉香氣成分色譜圖

2.2 水浴萃取時間的優化

要使頂空、吸附薄膜和茶葉三相中物質均衡分配，并且保持在一定的平衡狀態。分析物成分在三相中達到平衡所需要的時間即為在水浴中的萃取時間。萃取時間分別為15，30，45，60和90 min時的香氣成分的出峰情況如圖2所示。萃取吸附時間對茶葉香氣成分的出峰情況有所影響，吸附時間越長，香氣成分附著在萃取針就越多，但前面吸附的成分會脫附。經過比較在60和90 min時的出峰較多，響應值較好。萃取60 min，出峰數量達到最多，峰面積也達到最大，化合物的種類含量的萃取量達到最大值。隨著水浴時間增加，大分子化合物出峰時間向后推移且萃取值相對減小，萃取時間對萃取量的影響有所不同。綜合其色譜峰數量和峰面積大小，結果發現吸附萃取60 min的圖譜最佳。故選擇水浴萃取時間60 min。

圖2 水浴溫度下不同吸附時間茶葉香氣成分色譜圖

2.3 氣相升溫程序的優化

氣相質譜檢測條件是：DB-5MS氣相毛細管柱（30 m，0.25 mm，0.25 μm），進樣口溫度250 ℃，進樣時間1 min，分流進樣，柱流速1 mL/min，質譜接口溫度280 ℃，離子源溫度200 ℃，質譜掃描范圍m/z35～550。

通過改變不同的升溫程序，確定條件為：起始柱溫40 ℃保持2 min，3 ℃/min升溫到170 ℃，以20 ℃/min升溫到270 ℃，保持2 min。總共43.50 min，在此條件下能使色譜峰的分離度達到最佳。相應色譜圖如圖3所示。

2.4 氣相色譜分流比的優化

分流比就是樣品進到進樣口后汽化產生的氣體，進入色柱與排出進樣的比例。因為樣品汽化產生的氣體不可能完全進入色譜柱，進行分離，再進入測器檢測，一方面原因在于色譜柱的載樣量不是無限大，過多的樣品進入色譜柱會超載，造成分離效能下降，峰變形拖尾，還會影響到使用壽命；另一方面，色譜柱比較細，樣品汽化產生氣體膨脹后，不可能瞬間進入色譜柱，需要一定的時間，但又需要控制時間的長度，否則譜帶會變寬。通過不同的分流比來選擇合適的測試條件（分流比1︰1，1︰2和1︰5），出峰情況如圖12～圖14所示。分流比在1︰1和1︰2時的出峰情況比較好，綜合考慮選擇分流比1︰2的測試條件。

2.5 不同年份白茶（特級牡丹、高級牡丹、一級牡丹）香氣成分分析比較

2.5.1 不同年份特級牡丹香氣成分的差異

從圖5的（a）和（b）可以看出特級牡丹香氣化合物質總體的變化規律是隨著儲存時間延長，物質增加，大部分香氣物質減少，部分香氣物質增加，并且增加比較明顯。

2017年特級牡丹的主要香氣成分有116種，其中醛類16種、酯類9種、酮類18種，碳氫類46種、醇類15種、其他類12種；醇類化合物占色譜峰面積的34.8%。2007年特級牡丹中測得的主要香氣成分有100余種。測得的特級牡丹的主要香氣成分有芳樟醇、苯甲醛、苯乙醇、氧化芳樟醇、甜樺油、苯甲醇、β-紫羅酮、4, 6-二甲基十二烷、壬醛、十二烷、4-[2, 2, 6-三甲基-7-氧雜二環[4.1.0]庚-1-基]-3-丁烯-2-酮、1-十六烯、十四烷、二氫獼猴桃內酯、正己醛、咖啡因、2,6, 10-三甲基十三烷、2-己烯醛、反式-氧化芳樟醇、2-己基-1-癸醇、棕櫚酸甲酯、N-乙基琥珀酰亞胺。

圖4 不同分流比下茶葉香氣成分色譜圖

圖5 不同年份特級牡丹香氣色譜圖

從所檢測的數據中可得，2007年比2017年香氣成分含量大部分減少，其中芳樟醇含量最大，減少量也最多，由23.53%降到5.89%，10年降低將近5倍，含量排名第二的苯甲醛也由原先的6.27%下降至1.47%，而2007年的β-紫羅酮則較2017年下降92.6%，為所有主要香氣中下降最多的成分。但也有一部分香氣成分含量增加，如苯乙醇、苯甲醇、壬醛、咖啡因、2, 6,10-三甲基十三烷、反式-氧化芳樟醇、2-己基-1-癸醇、棕櫚酸甲酯、N-乙基琥珀酰亞胺等。其中，N-乙基琥珀酰亞胺、棕櫚酸甲酯和咖啡堿，10后的含量分別為2007年的8.2，2.5及2.3倍。

2.5.2 不同年份高級牡丹香氣成分的差異

對于高級牡丹來說，檢測出的前20的香氣成分含量大部分在隨著儲存時間增加而減少。2012年的高級牡丹，含量最高的是苯乙醇，占總體的6.33%，而在2007年中含量最高的是4, 6-二甲基十二烷（5.45%），醇類總量由2012年的22.41%下降為2007年的8.4%，而碳氫類總量則由2012年的6.86%上升至2007年的10.32%，這可能與白茶貯藏陳化過程發生的變化有關。也有一小部分含量在增加，如4, 6-二甲基十二烷、咖啡因、N-乙基琥珀酰亞胺、壬醛、3, 7-二甲基癸烷等。其中，具有月下香及紫羅蘭香氣的2-己基十二醇和具有溫和的柏木香氣的柏木腦分別為2012年的8.9倍和2.6倍。

圖6（a）和（b）中高級牡丹香氣化合物質總體的變化規律是隨著儲存時間延長，物質由大變小。高級牡丹的主要香氣成分有苯甲醇、苯乙醇、氧化芳樟醇、苯甲醛、4, 6-二甲基十二烷、咖啡因、二氫獼猴桃內酯、N-乙基琥珀酰亞胺、反式-氧化芳樟醇、壬醛、順-Α, Α-5-三甲基-5-乙烯基四氫化呋喃-2-甲醇、3-甲基十一烷、棕櫚酸甲酯、苯乙醛、3, 7-二甲基癸烷、二環己基甲酮、2-己基十二醇、5-(2-甲基丙基)壬烷、2, 4-二叔丁基苯酚、柏木腦。

圖6 不同年份高級牡丹香氣色譜圖

2.5.3 不同年份一級牡丹香氣成分的差異

不論是2016年還是2014年，一級牡丹香味成分中含量最高且種類最多，均為碳氫化合物，分別占總香氣成分物質的19.51%和15.39%，這與之前特級牡丹和高級牡丹的檢測結果稍有區別，也反映出不同等級批次的白茶在香氣的組成比例上存在一定差異，這也是區別不同品級白茶的關鍵所在。雖然年份相隔不遠，但經過2年存放，特級和高級牡丹中均存在的N-乙基琥珀酰亞胺和一級牡丹特有的帶有土壤氣味的3, 5-辛二烯-2-酮消失。但3-甲基十一烷、反式-氧化芳樟醇、苯甲醇、4, 6-二甲基十二烷等卻有所增加。特別是苯甲醇，2014年較2016年增加4.4倍。

圖7（a）和（b）的一級牡丹香氣化合物質總體的變化規律是隨著儲存時間延長，物質由少變多又變少。2016年的一級牡丹香氣物質比2014年的大得多。一級牡丹的主要香氣成分有十二烷、咖啡因、苯甲醛、十四烷、芳樟醇、壬醛、苯乙醇、2, 6, 10-三甲基十五烷、2, 3a-二甲基六氫茚滿-苯并呋喃、氧化芳樟醇、β-紫羅酮、2-溴十二烷、二氫獼猴桃內酯、3-甲基十一烷、N-乙基琥珀酰亞胺、反式-氧化芳樟醇、棕櫚酸甲酯、苯甲醇、4, 6-二甲基十二烷、2, 4-二叔丁基苯酚、3, 5-辛二烯-2-酮、甜樺油、4-[2, 2,6-三甲基-7-氧雜二環[4.1.0]庚-1-基]-3-丁烯-2-酮。

圖7 不同年份一級牡丹香氣色譜圖

3 討論與結論

試驗研究在不同萃取溫度和萃取時間下頂空微萃取對白茶香味物質的富集效果，結果表明，在70 ℃萃取溫度下持續萃取60 min，其萃取效果最佳；GC-MS最優分析條件為：手動進樣，分流比1︰2；進樣口溫度250 ℃，GM-MS接口溫度250 ℃；升溫程序：起始柱溫40 ℃保持2 min，以4 ℃/min升至170 ℃保持1 min，后再以20 ℃/min升至270 ℃，保持2 min。

白茶的儲存時間對茶葉香氣成分有很大的影響，含量會發生明顯的變化。隨著儲存時間延長，茶葉香氣中的成分含量會發生改變，有的香氣成分會減少甚至消失，如醇類化合物均有不同程度的降低，其他香氣成分如花果香型的芳樟醇及其氧化物[9-11]，有微弱蘋果香氣的苯甲醛，具有柔和玫瑰花香的苯乙醇[12]，有紫羅蘭和木香香氣的β-紫羅酮[13]，有麝香氣息混合香豆素的二氫獼猴桃內酯[14]等白茶中的主要香氣成分降低或是分解，使白茶清鮮、毫香感逐漸減少甚至消失。但有的香氣成分含量會增加，如咖啡因，白茶中只有一級牡丹的咖啡因含量隨著茶葉年份增加而降低，而特級牡丹和高級牡丹則是茶葉年份越久，咖啡因含量越高。此外，碳氫化合物，特別是烯類，也有不同程度增加，這可能是白茶貯藏陳化過程中的一個特點。所檢測的烷烴類物質雖無芳香氣味，但可能是通過與其他香氣物質的互作效應從而間接促進香氣的形成[15]。白茶中的主要香氣成分與相關研究基本相同，但若干香氣成分的結果有所偏差，可能是因為所采茶葉在制作的過程、儲存條件、儲存時間上的差異，或是試驗操作過程中的一些偏差所致。