靈芝液體培養基優化及飲品加工工藝

許俊齊，曹正*，王瑞，凡軍民，謝正林，劉勇

江蘇農林職業技術學院茶與食品科技學院（句容 212400）

靈芝（Ganoderma lucidum）屬真菌門，擔子菌綱，多孔菌目，多孔菌科，靈芝屬，是一種珍貴的藥用真菌，含有多種生物活性物質，如靈芝多糖、三萜類化合物和多種酶類，具有極高的營養保健和藥用價值[1]。中國古代稱其子實體為“仙草”[2-3]。

文獻報道表明，多糖類物質（Polysaccharides）作為靈芝主要的有效化學物質之一，靈芝多糖具有調節免疫能力、抗腫瘤、抗氧化、抗HIV、降血壓等生物活性，且經毒理學驗證表明，靈芝多糖不會對人體健康造成負面影響[4-6]。靈芝多糖主要來源于固態發酵中的子實體和孢子以及液體發酵中的菌絲體和胞外發酵液，其產量的高低與試驗菌株、培養基和培養條件等因素密切相關[7-9]。

近年來由于野生靈芝資源有限且人工栽培靈芝子實體周期較長、栽培成本高，限制了靈芝的廣泛應用。目前，利用發酵技術生產真菌具有容積大、產量高、周期短和無污染等特點，已成為醫藥和保健品、化妝品等原料的重要生產方式[9]。通過液體發酵所得靈芝菌絲體，產品苦味小，營養價值及有效成分不低于子實體，甚至有些指標高于子實體，因而具有廣闊的開發和應用前景[10-11]。

試驗通過對靈芝進行液體深層發酵培養，分析相應碳源、氮源及培養溫度與裝液量對其菌絲干質量與總多糖含量的影響。在此基礎上，進行靈芝菌絲發酵飲品調配配方進行優化，以期為靈芝菌絲產品的開發提供借鑒作用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

靈芝菌種及金針菇，江蘇食用菌研究所所提供；纖維素酶（120 U/g），任丘市力輝化工有限公司；食鹽、馬鈴薯等，市售；葡萄糖、硫酸銨、磷酸二氫鉀、蛋白胨和可溶性淀粉，國藥集團化學試劑有限公司。

恒溫培養箱，上海躍進醫療器械廠；FA 2104 N分析天平，上海精密科學儀器有限公司；超凈工作臺，蘇州凈化設備有限公司；DHG-9123 A電熱鼓風干燥箱，上海一恒科學儀器有限公司；L 520微波爐，合肥榮事達三洋電器股份有限公司；CH 2176電磁爐，杭州九陽生活電器有限公司；HS-6恒溫水浴鍋，金壇市杰瑞爾電器有限公司；電子分析天平，瑞士梅特勒-托利多公司。

1.2 培養基

1.2.1 斜面培養基

馬鈴薯200 g，葡萄糖 20 g，瓊脂20 g，磷酸二氫鉀2 g，硫酸鎂1 g，VB110 mg，水1 000 mL。

1.2.2 一級搖瓶培養基

葡萄糖2%，酵母浸出膏15%，蛋白胨0.2%，磷酸氫二鉀0.1%，硫酸鎂0.05%，磷酸二氫鉀0.05%，VB10.005%，余量為水。

1.2.3 二級搖瓶培養基

馬鈴薯20%，蔗糖2%，硫酸銨0.2%，磷酸二氫鉀0.1%，硫酸鎂0. 05%，VB10.005%，余量為水。

1.2.4 發酵培養基

可溶性淀粉6%，葡萄糖2%，蛋白胨0.8%，硫酸銨0.2%，磷酸二氫鉀0.1%，硫酸鎂0.05%，VB10.005%，余量為水。

1.3 試驗方法

1.3.1 靈芝菌絲飲品加工步驟

1.3.1.1 菌種活化

將靈芝菌種接種到斜面培養基上，在28 ℃的生化培養箱中培養5～7 d左右，菌絲可長滿試管。

1.3.1.2 一級搖瓶培養

將經過活化的靈芝菌種接種到搖瓶培養基中（500 mL的三角瓶裝液150 mL），一級搖瓶培養條件為接入經過斜面培養的靈芝菌種2 cm2，于28 ℃條件下，振蕩培養5～6 d。

1.3.1.3 二級搖瓶培養

將一級搖瓶培養靈芝菌種的接種到搖瓶培養基中進行二級搖瓶培養，在28～30 ℃條件下，培養8 d，所得靈芝菌種為生產搖瓶二級種。

1.3.1.4 發酵培養

將二級種接入發酵培養基中，二級種與發酵培養基的體積比為10%的接種量接種于發酵培養基中，發酵培養5 d，進行擴大培養，得到一級靈芝菌種。

1.3.1.5 發酵罐培養

一級靈芝菌種接入裝有發酵培養基的發酵罐中進行發酵罐培養24～36 h后，過濾，得靈芝菌絲。

1.3.1.6 靈芝菌絲飲品制備

過濾后的靈芝菌絲球于35～40 ℃烘干至恒質量，粉碎后過200目篩。將靈芝菌絲球粉及適量水（1︰5）進行均質研磨，均質完成后將靈芝菌絲球混液中加入0.2%纖維素酶，混勻后于38 ℃條件下保溫水解1.5 h，將混合料在100 ℃下殺菌10 min。

準備好的靈芝菌絲酶解濾液，分別加入溶解完成的果膠及黃原膠，再依次加入金針菇粉、鮮柚濃縮汁、蜂蜜、檸檬酸、檸檬酸鈉，然后攪拌均勻，最后補水至配方規定的量；將定容后的料液加熱至沸，趁熱加灌入已滅菌的飲料瓶、壓蓋后105 ℃下殺菌10 min、冷卻后得靈芝菌絲發酵飲品。

1.3.2 液體培養基成分及條件單因素試驗

前期試驗基礎上，判定液體培養基中碳源可溶性淀粉含量、氮源中蛋白胨及培養溫度與不同裝液量的對靈芝液體菌絲生長情況存在顯著影響，故設定可溶性淀粉添加比例為3%，4%，5%，6%和7%；蛋白胨添加量為0.6%，0.7%，0.8%，0.9%和1.0%；培養溫度與裝液量（以500 mL計）分別為20 ℃+120 mL，23 ℃+130 mL，26 ℃+150 mL，29 ℃+170 mL和32℃+180 mL，并以菌絲體干質量及總多糖含量為評價指標，試驗重復3次，取平均值，確定三者最優的添加量。

1.3.3 正交試驗

從單因素中篩選出的不同水平的可溶性淀粉濃度、蛋白胨、培養溫度與不同裝液量，并設置一列空白列，進行L9(34)正交試驗，因素及水平設定見表1。每個處理3個重復，進行振蕩培養，測定其菌絲體鮮質量及總多糖含量。

表1 靈芝液體培養基正交L9(34)試驗因素與水平

1.3.4 正交試驗

在前期試驗基礎上，認為鮮柚汁、金針菇粉及檸檬酸+檸檬酸鈉為影響靈芝菌絲體發酵飲品的關鍵因素。分別設定蔗糖添加比例為4%，5%和6%；設置食鹽添加量為0.01%，0.02%和0.03%，設置檸檬酸與檸檬酸鈉添加比例為0.3%+0.03%，0.4%+0.04%和0.4%+0.04%，設置果膠與黃原膠添加比例為0.04%+0.06%，0.05%+0.08%和0.06%+0.1%，并設置一列空白列，進行L9(34)正交試驗，因素及水平設定見表2。

表2 靈芝菌絲發酵飲品L9(34)試驗因素與水平

1.3.5 指標測定方法

1.3.5.1 感官評定

取試樣置于燒杯中，在自然光下觀察色澤和組織狀態。聞其氣味，用溫開水漱口，品嘗滋味。感官品質得分為3個指標總和。感官評價由20名具有品評經驗的食品專業同學進行評價，取其平均值。

外觀（10～30分）：細膩潤滑，組織連貫均一，無結塊和分層、無固體析出、色澤一致，無沉淀。

口感（10～40分）：口感爽滑，口味醇厚。

風味（10～30分）：飲品的酸甜度適中、飲品香氣濃厚，獨特飲品酵香。

1.3.5.2 靈芝菌絲體干質量測定方法

靈芝菌絲體發酵液，采用100目篩網過濾，用稱質量后的干燥濾紙抽濾，將菌絲體用蒸餾水抽濾3次，烘干至恒質量后稱質量，即得靈芝菌絲體干質量。

1.3.5.3 總多糖測定

總多糖測定：參照苯酚-硫酸法[12]。

1.3.5.4 微生物指標的測定

菌落總數按照GB 4789.2—2010《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數測定》進行測定。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

靈芝菌絲對淀粉的利用率較高，可溶性淀粉屬于緩慢型利用碳源，易于被靈芝菌絲體快速利用且可滿足菌絲后期生長的需要，故靈芝液體菌種培養基中添加可溶性淀粉時，菌絲干質量及總多糖含量隨添加比例的增高，而有所增加?？扇苄缘矸厶砑恿繉`芝菌絲體干質量及總多糖含量的影響具體見圖1。結果表明，麥芽糖添加量分別為5%和6%時，靈芝菌絲總多糖含量為1.441 g/L，靈芝菌絲干質量達0.534 g/100 mL，可溶性淀粉添加量7%，菌絲干質量及總多糖含量與添加比例6%時增加不明顯，故選擇可溶性淀粉添加量6%作為靈芝菌絲生長最適添加比例。

圖1 可溶性淀粉添加量對靈芝菌絲體干質量及總多糖含量的影響

蛋白胨富含有機氮化合物，亦含有一些維生素和糖類，常被作為微生物培養基的主要原料。蛋白胨添加量對靈芝菌絲體干質量及多糖含量的影響見圖2。結果表明，蛋白胨添加量對靈芝菌絲干質量及總多糖含量影響較為明顯，蛋白胨添加量0.8%時，每100 mL培養液中的菌絲鮮質量達0.539 g，總多糖含量達1.365 g/L。隨添加比例增加，靈芝干質量增加不明顯，總多糖含量反而趨于小幅下降。原因可能在于，過量營養對于菌絲增長并無明顯作用，據此選擇0.8%蛋白胨添加量為最適液體培養基添加量。

隨著培養溫度不斷升高及裝液量增加，靈芝菌絲干質量不斷增加且總多糖含量也逐步增加，但在29 ℃后繼續升溫，菌絲量反而減少，可見29 ℃為最適培養溫度，具體見表3。培養溫度及裝液量為29 ℃、170 mL時，菌絲干質量達0.534 g/100 mL，總多糖含量達1.414 g/L。培養基裝液量多，發酵液中溶氧量就少，影響菌球的生長，而裝液量過少，雖然溶氧量很大，但營養不足，菌絲干質量及多糖含量就低。故選擇培養溫度29 ℃及裝液量170 mL為較佳的靈芝液體培養基的培養條件。

表3 培養溫度及裝液量對靈芝菌絲體干質量及總多糖含量的影響

2.2 靈芝液體培養基工藝優化

2.2.1 正交試驗結果的極差分析

液體培養基L9(34)試驗結果分析見表4。

由表4液體培養基優化正交試驗表中的R值可知，影響靈芝菌絲干質量及總多糖含量的主次順序皆為：A＞B＞C，即培養溫度及裝液量＞可溶性淀粉添加量＞蛋白胨添加量。根據液體培養基配方及培養條件優化的結果分析得出，優化后的配方為A2B3C3，即液體培養基最佳配比：培養溫度29 ℃、裝液量170 mL、可溶性淀粉添加量6.5%、蛋白胨添加量0.85%。靈芝菌絲在此配方及環境條件下生長狀況良好，總多糖含量保持在較高水平。

對試驗結果進行方差分析，即在試驗條件下，培養溫度及裝液量與蛋白胨添加量對靈芝菌絲干質量及菌絲總多糖含量影響極顯著（p＜0.01），可溶性淀粉添加量對兩者影響顯著（p＜0.05）。

表4 液體培養條件及培養基L9(34)試驗結果分析

2.2.2 擴大性驗證試驗

獲得的優化方案A2B3C3為試驗中的9號試驗組，為進一步確認其在實際生產中的可靠性與可行性，故以其為條件，即培養溫度29 ℃、裝液量170 mL、蛋白胨添加量0.85%、可溶性淀粉添加量6.5%，進行擴大性（中試）驗證試驗，試驗重復3次，測定其菌絲干質量平均值為0.597±0.012 g/100 mL，總多糖含量為1.522±0.014 g/L試驗結果與9號試驗組相近，表明該配方為較佳的靈芝液體培養條件及其組成。

2.3 靈芝菌絲發酵飲品調配工藝優化

2.3.1 正交試驗結果的極差分析

靈芝菌絲發酵飲品調配L9(34)試驗結果見表5，靈芝菌絲鮮質量方差分析見表6。

從表5靈芝菌絲發酵飲品調配工藝的正交試驗結果中的R值可知，影響其綜合評分的因素主次順序為B＞A＞C，即金針菇粉＞食鹽添加量＞檸檬酸與檸檬酸鈉。依據綜合評分的結果分析可知，優化的工藝組合均為A2B3C3，即食鹽添加量0.03%、金針菇粉添加量0.6%、檸檬酸0.06%+檸檬酸鈉0.10%，制得的飲品外觀、口感及風味的綜合值均保持在最高。

對試驗結果進行方差分析，表6數據顯示，在試驗條件下，食鹽添加量與金針菇粉添加量對靈芝菌絲發酵飲品的綜合口感影響顯著（p＜0.05），而檸檬酸+檸檬酸鈉對其影響不顯著（p＞0.05）。

2.3.2 擴大性驗證試驗

獲得的優化方案A2B3C3為試驗第9組試驗，為進一步確認其在實際生產中的可靠性與可行性，以其為條件，即靈芝菌絲飲品調配配方為：食鹽添加量0.03%、金針菇粉添加量0.6%、檸檬酸0.06%+檸檬酸鈉0.10%。進行擴大性（中試）驗證試驗，試驗重復3次，經品評后，綜合得分達85.8分，試驗結果均優于正交試驗的9組試驗組，表明此配方為較佳的靈芝菌絲飲品的適宜配方。

2.4 微生物指標檢驗

靈芝菌絲飲品的微生物檢驗結果見表7。結果表明，靈芝菌絲飲品的細菌總數≤100 CFU/mL，大腸桿菌≤3 MPN/100 mL，致病菌未檢出，符合GB 7101—2015《食品安全國家標準 飲料》中關于微生物限量要求。

表5 靈芝菌絲發酵飲品調配L9(34)試驗結果

表6 靈芝菌絲飲品方差分析

表7 微生物檢驗結果

3 結論

對靈芝液體培養基碳源、氮源、培養溫度及裝液量進行優化，試驗結果認為，培養溫度29 ℃、裝液量170 mL、蛋白胨添加量0.85%、可溶性淀粉添加量6.5%，靈芝菌絲體菌絲干質量平均值為0.597±0.012 g/100 mL，總多糖含量為1.522±0.014 g/L；在對靈芝菌絲發酵飲品調配工藝過程中，通過正交試驗分析得出，最優組合為：食鹽的添加量0.03%、金針菇粉添加量0.6%、檸檬酸0.06%+檸檬酸鈉0.10%。綜合感官評價認為，此配方制得的靈芝菌絲飲品在保證口感的同時，后期貯藏驗證其穩定性也較高。

通過對在最佳工藝條件下制得的靈芝發酵菌絲飲料進行感官評價，其顏色均一，組織狀態均勻，無沉淀分層現象，在保留靈芝菌絲原有的活性功能基礎上，添加鮮柚濃縮汁及蜂蜜，使靈芝飲品的營養更加豐富，風味獨特，口感更加細膩，具有良好的市場前景。