酵母菌和乳酸芽孢桿菌發酵佛手果酒工藝

吳姍姍，田文妮，陸思名，蔡欣，黎攀，杜冰*

華南農業大學（廣州 510642）

佛手（Citrus medica L.，Var. Sarcodactylis）為蕓香料柑桔屬植物，又名佛手柑、佛手香櫞、蜜羅柑等。我國佛手資源豐富，藥用歷史悠久，主要用于通氣化痰、止痛等，此外佛手還具有抗氧化、抗衰老、抗菌、抗腫瘤、提高免疫力等功效[1]。近年來，對佛手果的開發利用研究主要有佛手精油、佛手含片、佛手果脯、佛手酸奶及佛手果酒等[2]，發酵果酒因其口感獨特、營養豐富，越來越受到消費者青睞，但目前佛手果酒多是以酵母菌單獨發酵，而結合乳酸菌一起復合發酵制備佛手果酒鮮有報道。

乳酸菌和釀酒酵母菌混合發酵在乳制品、飲料和果酒等制品中有廣泛的應用，相對于僅用單一菌的發酵制品，在營養價值和保健功能等方面都更有積極的作用，不僅具有原有材料的營養與功效成分，又賦予了發酵制品獨特的口感與風味。乳酸芽孢桿菌DU-106兼具乳酸菌產酸和芽孢抗逆性強的特點，能夠抵抗許多不良外界因素的影響，比一般的益生菌更具使用優勢，適應多種環境[3]，在發達國家，有很多以乳酸芽孢桿菌為主要成分的產品已經在市場上流通銷售[4]。

試驗以廣西佛手為主要原料，經產乳酸芽孢桿菌和酵母混合發酵，確定佛手果發酵酒的最佳工藝條件，為佛手果的開發利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

佛手，產自廣西；釀酒酵母菌171，購于安琪酵母公司，并為實驗室保存；乳酸芽孢桿菌DU-106，菌粉濃度為1×1012CFU/g，為華南農業大學食品學院106保藏；市售白砂糖；β-環狀糊精、氯化鈉、氫氧化鈉均為分析純。

1.2 主要設備與儀器

VD-650超凈工作臺，蘇州凈化設備有限公司；DHP-600電熱恒溫培養箱，北京市永光明醫療儀器廠；DHG-9070 A電熱恒溫鼓風干燥箱，上海精宏實驗設備有限公司；PHS-3C精密pH計，上海精密科學儀器有限公司；精密電子天平，北京賽多利斯天平有限公司；高壓滅菌鍋，蘇州凈化設備有限公司；25 mL附溫比重瓶，上海市信誼儀器廠有限公司；手持式折光儀，溫州標諾儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 工藝流程

1.3.2 工藝要點

1.3.2.1 佛手果脫苦處理

取新鮮佛手（去皮）100 g置于燒杯中，切成2 cm×2 cm×2 cm左右的小塊，加入100 mL蒸餾水及0.78 gβ-環狀糊精，44 ℃水浴鍋水浴42 min[5]。

1.3.2.2 菌種活化

菌種選用產乳酸芽孢桿菌DU-106和釀酒酵母菌171。分別配制50 mL生理鹽水和50 mL 5%糖水，用高壓滅菌鍋于121 ℃下滅菌15 min，分別加入0.1 g產乳酸芽孢桿菌菌粉和2.5 g釀酒酵母菌，30 ℃下活化30 min鐘。

1.3.2.3 發酵

將脫苦后的100 g佛手果塊置于2.5 L發酵罐中，倒入100 mL蒸餾水，加入適量白砂糖，接種，混合搖勻，在試驗設定溫度下發酵。

1.3.3 單因素試驗

以接種量（0.10%，0.20%，0.30%，0.40%和0.05%）、發酵溫度（20，23，26，29和32 ℃）、初始糖度（10%，15%，20%，25%和30%）和發酵時間（3，5，7，9和11 d）為單因素控制變量，測定發酵后佛手果發酵酒的pH、可溶性固形物含量、總酸及酒精度。

1.3.4 正交試驗設計

在單因素試驗結果的基礎上，選擇接種量、初始糖度及發酵溫度這3個因素進行正交設計試驗，每個因素選取3個水平，采用L9(34)正交表（表1），并根據感官評定表中的各項標準進行評分。

表1 正交試驗設計表

1.3.5 分析檢測

在設定的條件下進行試驗，以發酵開始記為0 d，在發酵的第3，5，7，9和11天取樣測定佛手果酒的感官指標、pH、總酸、可溶性固形物含量和酒精度，對其發酵過程的動態變化進行分析。

1.3.5.1 感官指標評定

根據佛手果酒的特性，選擇澄清度、香氣、滋味與色澤能反映果酒品質的指標為評價標準，每個指標為25分，總分為100分。感官評定標準見表2。

1.3.5.2 理化指標測定

pH，酸度計測定法；可溶性固形物，使用糖度計；總酸、酒精度，GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[6]。

2 結果與分析

2.1 單因素優化試驗

2.1.1 接種量對佛手果發酵影響

接種量過少，酵母轉化不完全，酒中殘糖含量高；當接種量過高，酵母繁殖需消耗營養物質，影響糖分轉化為酒精，也不利于發酵[7]。由圖1可知，隨著接種量的提高，佛手果酒總酸和酒精度逐漸上升，pH和可溶性固形物呈現下降趨勢，其中接種量對佛手果發酵酒的可溶性固形物含量以及酒精度有較大影響。可以看出，當接種量為0.20%時可溶性固形物含量明顯下降，說明此時菌種對佛手果發酵酒中的糖的利用率開始升高。另外，當接種量為0.30%時，酒精度為4.23%vol，當接種量為0.50%時，佛手果發酵酒的酒精度為5.14%vol，說明接種量在0.30%～0.50%范圍內酒精度變化不大，因此選擇接種量為0.30%。

表2 佛手果發酵酒各項感官評分標準

圖1 接種量對佛手果發酵酒的影響

2.1.2 發酵溫度對佛手果發酵影響

發酵溫度是影響佛手果發酵酒發酵品質的一個重要因素，溫度低時菌種代謝活力相對較弱，酵母轉化酒精以及產乳酸芽孢桿菌產酸能力較弱，酒精度較低，酸度不足，口感不佳；溫度過高會使酵母衰老加速[8]。由圖2可知，隨著發酵溫度的升高，可溶性固形物持續下降，酒精度和總酸含量升高。由圖2可以看出，在20～32 ℃，發酵溫度越高，果酒發酵程度越大。由圖2可以得出，當發酵溫度為32 ℃時，佛手果發酵酒中白砂糖的利用率最高，說明在此溫度下微生物活性相對較大，佛手果發酵酒發酵相對完全。因此確認32 ℃為佛手果發酵酒的最佳發酵溫度。

圖2 發酵溫度對佛手果發酵酒的影響

2.1.3 初始糖度對佛手果發酵影響

初始糖度對于佛手果酒的發酵是一個重要的影響因素，主要影響發酵后的風味以及微生物活動。高濃度糖會抑制菌種的生長繁殖，同樣使發酵不徹底[9]。由圖3可以看出，隨著初始糖度的增加，總酸、可溶性固形物、酒精度均增加，當初始糖度達到20%時，酒精度和可溶性固形物上升速率減緩，此時酒精度達到4.32%vol，考慮到佛手果發酵酒作為果酒，酒精度不宜過高，否則佛手原有的清新的風味將會被酒精味所遮蓋，因此選擇初始糖度為20%作為最佳添加量。

圖3 初始糖度對佛手發酵酒的影響

2.1.4 發酵時間對佛手果發酵影響

由圖4可知，發酵3 d時，佛手果發酵酒的pH與固形物含量較高，總酸含量較低，說明此時佛手果發酵酒中的菌種還沒有完全發揮活性，對白砂糖的利用率較低，發酵過程中所產的酸和酒精較低。在發酵5 d后，產乳酸芽孢桿菌和酵母在佛手果發酵酒中開始發揮活性，白砂糖的利用率逐漸增高，酒精度上升至1.32%vol。當發酵到第9天時，發酵速率有所下降，白砂糖的利用率與總酸產量的變化速率也有所下降。在發酵11 d后，發酵基本趨于穩定，各項指標變化幅度均有所降低。在發酵第7天時，佛手果發酵酒中pH為3.67，總酸為0.550 8 g/L，可溶性固形物含量為4.3%，酒精度4.23%vol，果酒澄清呈淡黃色，口感醇厚，感官評分較高，因此選擇最佳發酵時間為7 d。

發酵時間相對于其他因素對佛手果酒的影響較小，且發酵時間為7 d時感官評分最高，因此，確定發酵時間為7 d，不再選取發酵時間作為正交試驗的因素。

圖4 發酵時間對佛手發酵酒的影響

綜上，由單因素試驗結果可知，接種量為0.3%，發酵溫度為32 ℃，初始糖度為20%，發酵時間為7 d，在此發酵條件下可得出較為優質的佛手果發酵酒。

2.2 佛手果發酵酒正交試驗

在單因素試驗結果的基礎上，選擇接種量、發酵溫度及初始糖度這3個因素進行正交設計試驗，每個因素選取3個水平，采用(34)正交表。試驗設計方案及結果見表3，方差分析結果見表4。

由表3和表4可知，3個因素極差分析為RA＞RB＞RC，即佛手發酵果酒的影響因素為菌種接種量＞初始糖度＞發酵溫度。從直觀分析表可以看出，菌種的最佳接種量是0.30%，初始糖度的最佳為20%，發酵溫度最佳為25 ℃，此條件下發酵制備的佛手果酒感官評分最高，達到85.4分。

表3 果酒發酵正交試驗結果與分析

表4 果酒發酵正交試驗方差分析表

2.3 驗證試驗

為更好地驗證上述試驗的準確性，根據上述的試驗步驟對該最佳工藝條件再進行一次驗證試驗，并測定佛手果發酵酒的四項理化性質及感官評分。根據上述驗證試驗結果，在接種量為0.30%，初始糖度為20%，發酵溫度為25 ℃的最優發酵條件下制備的佛手果發酵酒的感官評分，為85.4分，系九組試驗中最高。因此通過驗證，可以得出佛手果發酵酒的最佳工藝為接種量為0.30%，初始糖度20%，發酵溫度25 ℃。

3 結論

通過單因素和正交試驗，優化并確立了佛手果發酵酒的最佳發酵工藝：接種量0.30%，發酵溫度為25℃，初始糖度為20%，發酵時間為7 d。在此條件下佛手果發酵酒的pH為3.67，總酸為0.55 g/L，可溶性固形物含量為4.30%，酒精度4.23%vol，感官評定為85.4分。