嘌呤能離子通道型受體7及其在周圍神經再生中的作用

何宛俞，黃積根，鄧禮勤，丁林威，張全鵬

1.海南醫學院基礎醫學與生命科學學院16級生物技術本科班，海南 海口 571199；2.海南醫學院基礎醫學與生命科學學院17級生物技術本科班，海南 海口 571199；

3.海南醫學院基礎醫學與生命科學學院18級生物技術本科班，海南 海口 571199；

4.海南醫學院基礎醫學與生命科學學院解剖學教研室，海南 海口 571199；

5.海南省熱帶腦科學研究與轉化重點實驗室，海南 海口 571199

嘌呤能離子通道型受體7 (purinergic ligand-gated ion channel 7 receptor，P2X7R)是嘌呤受體的一個亞型，是腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphosphate，ATP)門控的非選擇性離子通道[1]，在P2XR家族中，P2X7R在炎癥細胞和抗原呈遞細胞的激活中起著重要作用[2]。

1 P2X7R的結構和分布

P2X受體家族是由胞外ATP激活的離子化陽離子通道，允許陽離子如Ca2+、K+和Na+通過，ATP-P2X信號能使胞外Ca2+內流，導致神經組織中的離子遷移與細胞死亡[3]。人類P2X7R 定位于染色體12q24，由P2X7基因編碼P2X7R，其含有13 個外顯子，由595 個氨基酸殘基組成，有3 個同源亞基，每個亞基含有兩個跨膜結構域環和一個糖基化的胞外環，胞外環上有ATP結合位點，胞內含有一個長鏈羧基端(C 端)和一個短鏈氨基端(N 端)，其中C 端為P2X7R 主要的功能結構域[4]。這種受體主要表達于單核細胞、巨噬細胞[5]和哺乳類動物神經節中的衛星膠質細胞[6]。

2 P2X7R的功能

2.1 P2X7R促神經生長和促細胞增殖的作用 正常情況下，胞外ATP的濃度受到胞外ATP酶和ADP酶的嚴格調控，其濃度一直處于低水平[7]。神經細胞受到損傷后釋放ATP，促進周圍神經再生軸突定向的生長、促進再生軸突成熟、保護脊髓神經元和預防失神經支配的肌肉萎縮[8]。ATP-P2X7R 可通過MAPK/ERK 胞內信號轉導途徑促進細胞的增殖[9]。MAPK/ERK 通路通過多種磷酸化級聯反應參與調節多種細胞的生長和分化。同時有研究表明，周圍神經損傷后，ATP 促進雪旺細胞的增殖，在受損神經形成Büngner帶，促進軸突的生長和伸長[10]，干擾P2X7R基因促進巨噬細胞增殖[7]。shRNA抑制P2X7R基因抑制細胞增殖和誘導凋亡，間接提示P2X7R有促進細胞增殖和存活功能[11]。

2.2 P2X7R 與細胞損傷 細胞受到損傷時可引起P2X7R膜的通透性發生改變，如在低濃度的二價陽離子環境下，經過高濃度激動劑的長時間或反復刺激，P2X7R的膜通透性會發生改變，陽離子通道轉變為非選擇性的膜通道，可通透分子量達900 kDa左右的分子和離子[如：熒光素黃(lucifer yellow)、溴化乙錠等]。分子量較大的有機陽離子可通過這種通道進入細胞，改變了離子通透性，誘導細胞骨架重排，最終導致細胞溶胞死亡[12-13]。神經細胞受損會導致ATP 的濃度增高，P2X7R膜孔形成，表達P2X7R的鄰近細胞死亡，最終導致壞死細胞的數量增高[14]。在P2X7R介導下，膠質細胞釋放出的ATP作為神經元-膠質細胞通訊中的信號分子，膠質細胞受ATP刺激，其形態發生改變，P2X7R表達增加，在ATP持續刺激作用下可導致膠質細胞的凋亡，從而阻止炎癥反應的持續存在[15]。Akt是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，活化的Akt會通過磷酸化細胞內蛋白質來介導下游應答，包括細胞的存活、生長、增殖、細胞凋亡等生物學過程[16]。當膠質細胞受到損傷時，釋放的ATP作用于膠質細胞上的P2X7R，使P2X7R活化，釋放谷氨酸和ATP，調節神經元的興奮性[17-18]。ATP的釋放可使膠質細胞中細胞因子表達增強，膠質細胞間隙連接參與了神經保護過程，特別是谷氨酸毒性引起的損傷和保護神經元免受氧化應激[19]。ATP通過肥大細胞釋放組胺、前列腺素，通過免疫細胞產生和釋放細胞因子來參與炎癥的發展[20]。

2.3 小結 有證據表明，當神經細胞受到損傷后，其分泌的ATP 會作用于膠質細胞膜上的P2X7R，形成ATP-P2X7R信號通路，促進神經細胞軸突的生長和伸長，促進膠質細胞的增殖和生長[6]。同時有文獻報道，膠質細胞受到損傷后也會分泌ATP，促使膠質細胞發生形變，P2X7R 的表達升高，最終導致膠質細胞死亡[15]。ATP的釋放可以使膠質細胞上的細胞因子的表達升高，可保護神經元免受氧化應激和谷氨酸毒性介導的細胞損傷[19]。因此，P2X7R 在周圍神經再生中的功能尚未完全明確。

3 P2X7R 在周圍神經再生中具體作用的研究方法

在活體動物模型中，可以通過P2X7R基因敲除來使機體分泌細胞因子和能力下降，緩解炎癥反應[21-22]，但敲除P2X7R基因仍能夠檢測到該蛋白的陽性表達[23]。在研究腫瘤細胞時，可以通過shRNA轉染抑制P2X7R基因表達，進而抑制細胞增殖能力并誘導細胞凋亡[11]。在研究正常的在體細胞時，將P2X7R-shRNA 重組質粒轉染至靶細胞，抑制P2X7R 蛋白的表達，從而促進細胞生長，提高細胞增殖活性；還可以采用RNA干擾技術構建穩定干擾P2X7R基因，該基因被抑制后，細胞生長和增殖活性明顯升高[7]。而P2X7R抑制劑BBG和激動劑2'(3')-O-(4-苯甲酰基)腺苷5'-三磷酸三乙基銨鹽(Bz ATP)也是研究P2X7R功能丟失和功能獲取后觀察其功能的一種常用方法。P2X7R 抑制劑有Briliant Blue G(BBG)、AZD9056、A438079、CE224 和535[24]、oxidized ATP[25-26]，其中BBG是最常用的抑制劑，P2X7R激動劑有Bz ATP、ATP、2-MeSATP、α,β-meATP[27]，其中，研究P2X7受體功能最常用的激動劑是Bz ATP。

4 P2X7R抑制劑BBG和激動劑Bz ATP

4.1 BBG 的作用機理 P2X7 受體抑制劑BBG可拮抗抑制膠質細胞上的P2X7R發生變構，使ATP不能與其結合，中斷了ATP-P2X7R 的信號通路，使神經細胞免受ATP誘發的興奮性損傷，減少炎性介質的釋放，降低了細胞的死亡率[13，28]。P2X7受體活性通過促進細胞的存活和增殖，調節增殖和分化途徑，而抑制劑則可能導致分化和軸突的形成，抑制神經元死亡率的增長[3]。這個機制意味著當ATP和P2X7R受體結合時，其他藥物就很難與該受體結合，也防止了受體和抑制劑的結合[29]。

4.2 BBG 的使用方法及優缺點 在無菌條件下稱取1.7 g BBG，加PBS 溶液溶解后調整濃度至100 mmol/L，于-20℃儲存，用時再稀釋成100 nmol/L濃度，可用于細胞培養時對細胞進行干預[12]。也可用BBG 腹腔注射，劑量為5 mg/100 g[30]。BBG 具有以下優點：(1)滲透壓和pH 值較穩定，染色效果好；(2)不是熒光染料，不會產生光毒性；(3)染色所需要的濃度低；(4)是新型的生物染色劑，無生物毒性[31-33]。在配置BBG 時，微量的BBG 粉末需要用到大量的溶劑來進行稀釋，在實驗中難以把控其劑量。

4.3 Bz ATP 的作用機理 Bz ATP 是最有效的P2X7受體激動劑，Bz ATP誘導的痛覺過敏僅由P2X7受體激活介導其誘導劑量依賴性的機械超負荷[34]。ATP激活膠質細胞細胞膜上P2X7受體，形成非選擇性陽離子通道，這時K+、Na+和Ca2+等離子跨膜性流動具有很強的選擇性，在這一環境下P2X7 受體的激活使離子通道擴張，形成可以允許分子量達900 kDa 左右的分子和離子通過的孔道，大分子物質可順利通過并改變細胞的功能狀況，其始動環節是ATP 介導P2X7受體構象發生了改變，形成離子通道[35-36]。

4.4 Bz ATP 的使用方法及優缺點 在無菌條件下，5 mg Bz ATP加入PBS溶液，調整濃度至1 mmol/L，于-20℃儲存，用時再稀釋成100 μmol/L 濃度[12]。Bz ATP 腹 腔 注 射 的 劑 量 為5 μg[30]。P2X7R 激 動 劑Bz ATP(100 μmol/L)刺激細胞后，在增加細胞內Ca2+水平和遷移的同時，既不影響細胞增殖，也不引起膜孔開放[37]。P2X7受體激動劑效價最好的是Bz ATP，該物質是穩定的ATP類似物，其效價遠遠大于ATP，其激活人和大鼠P2X7受體的效能是ATP的50倍[38-39]。機體的損傷可引起P2X7R活化，神經細胞釋放大量的ATP，作用于衛星膠質細胞上的P2X7R并使其活化。P2X7R活化機制如下：(1)通過谷氨酸轉運體的胞吐機制從神經細胞內轉運出ATP，神經細胞內的K+和Ca2+的遷移；(2)神經細胞釋放ATP，其作用于衛星膠質細胞上的P2X7R并使其活化，促進炎癥介質的釋放；(3)炎癥介質的釋放直接或間接使細胞損傷、死亡和凋亡[40-41]。

5 展望

蛋白的功能可以通過其激動劑和抑制劑的干預來達到研究目的，還可以通過基因敲除來消除或減弱該蛋白的表達以及通過轉染的方式來增強該蛋白的表達。但是在體動物的模型研究中，發現機體的P2X7R基因并不可以完全的敲除掉，但P2X7R的基因敲除可以減弱ATP-P2X7R 信號通路而引起的炎性反應。衛星膠質細胞和神經細胞的相互作用的機制復雜，目前尚不完全闡明清楚，本文為研究衛星膠質細胞P2X7R在神經再生中的具體功能提供方法學支持。