閾值法與二階求導法應用于HCV-RNA熒光定量PCR的精密度比較

楊 輝，馬 亮，叢 笑，劉 倩，于 洋

（中日友好醫院 檢驗科，北京 100029）

以聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）為基礎的核酸檢測方法特異、敏感，在病原微生物診斷領域應用極廣[1~3]。 丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）RNA定量檢測適用于HCV 現癥感染的確認、 抗病毒治療前基線病毒載量分析以及抗病毒治療過程中、治療結束后的應答評估[4，5]。

丙型肝炎治療過程中的監測與方案調整，在不同程度上依賴HCV RNA 定量結果的穩定性。 我國臨床使用的HCV RNA 定量法， 針對同一批擴增曲線采用不同的分析方法對定量結果影響的研究很少。 在實際操作中，閾值法與二階求導法容易混淆使用。為了解閾值法與二階求導法對HCV-RNA 定量（外標法）精密度的影響，我們利用臨床樣本通過Light Cycler480Ⅱ檢測系統對2 種分析法進行了比較。

1 資料和方法

1.1 樣本來源

6 例HCV 陽性的RNA 樣本，來自中日友好醫院2018年11~12月醫囑為HCV-RNA 檢測的臨床樣本。

核對采血管，溶血、乳糜、黃疸者未納入分析。 留樣當日提取核酸，-20℃凍存備用。

1.2 試劑與儀器

HCV-RNA 提取與擴增試劑盒購自中山大學達安公司，Smart32 核酸提取儀購自中山大學達安公司，LightCycler480Ⅱ核酸擴增儀購自瑞士羅氏公司。

1.3 方法

HCV-RNA 提取和擴增檢測按廠家說明書進行（為減少影響因素，未添加內參模板）。 PCR 反應體系50μl，其中含酶擴增液30μl，核酸上樣量20μl。 PCR 循環參數：UNG酶50℃處理15min，95℃預變性15min，94℃變性10s，55℃延伸45s，共反應45個循環，每個循環延伸時讀取熒光信號，定量標準品分析使用外標法。

為方便敘述，參考文獻[6]，全文用“Ct 法”對應“閾值法”，分析采用“abs/Fit point”模式，用“Cp 法”對應“二階求導法”，分析采用“abs/2nd Derivative Max”模式。

1.3.1 重復性檢測

取6 例陽性核酸制成中等濃度的混合樣本，同一實驗批次重復25 次檢測， 即一個樣本獲得25 條擴增曲線，擴增曲線先后采用Ct 法和Cp 法進行分析， 平行檢測標準品，利用標準曲線計算核酸濃度，并比較二者CV 值差異。

1.3.2 統計分析

采用SPSS 10.0 統計軟件進行數據的正態性分析和配對t 檢驗分析。

2 結果

混合樣本重復檢測25 次，擴增曲線先后采用Ct 法和Cp 法進行分析， 計算核酸濃度和組內變異系數CV 值，閾值法CV 為23.12%，二階求導法CV 為7.75%；采用SPSS 10.0 統計，2組濃度值均呈正態性分布；應用配對t 檢驗，2組值存在統計學顯著差異（P=0.008）；與Ct 法分析比較，Cp 法分析得到的定量濃度的重現性更好（見圖1）。

3 討論

閾值法和二階求導法廣泛應用于real-time PCR 熒光定量（外標法）檢測。 閾值選擇與群體特征有關，要綜合考慮所有陽性曲線的形狀；擴增曲線連續二階求導，最大值對應的循環數，近似指數擴增期的終點[7]，是唯一值，與其他擴增曲線無關。所以，從數據的獲得過程來說，二階求導法獲得的Cp 值要比閾值法獲得的Ct 值更為穩定。

real-time PCR 熒光檢測的定量模型能放大檢測誤差。它的定量原理為lgC=K*Ct+B，是一個能變形為指數函數的對數模型。 模型的輸入數據為Ct 值，輸出數據為核酸濃度C。 通過這個定量模型，Ct 值的絕對誤差被轉換成核酸濃度C 的相對誤差。 Ct 值與真值相差1個單位，核酸濃度C與真值就可能相差1 倍，輸入數據的誤差被顯著放大。 因此， 控制好輸入數據Ct 值的穩定性將獲得明顯的精密度收益。 減少模型輸入數據的變異系數，如使用二階求導法取代閾值法可以減少核酸濃度的定量誤差。 所以，我們認為， 使用real-time PCR 技術定量監測丙肝患者的病毒載量變化時，優先選用精密度較高的二階求導法，其數據更為客觀。