大分子擁擠環境對不同糖基化MUC5AC折疊和聚集的影響①

景 雯 童 瑾

(重慶醫科大學附屬第二醫院呼吸與危重癥醫學科,重慶 400010)

慢性氣道炎癥黏液高分泌時，杯狀細胞內呈現異常擁擠狀態，而這種大分子擁擠環境有利于糖基附著于蛋白質上從而提高蛋白的糖基化程度[1]。研究發現，細胞內的大分子擁擠環境會使介質的黏度增加從而減少小分子物質和蛋白質的擴散速率[2，3]。因此我們推測氣道杯狀細胞內大分子擁擠推動高度糖基化MUC5AC的折疊和異常聚集從而發生分子構象、組態的改變。目前關于體外模擬大分子擁擠環境，研究其對蛋白質折疊和聚集影響作用的報道有很多，但尚未有關于MUC5AC糖基化在大分子擁擠環境中折疊和聚集效應的研究，本實驗首次在大分子擁擠環境中研究了氣道MUC5AC折疊和聚集過程，進而驗證了大分子擁擠影響糖基化MUC5AC的錯誤折疊并加速其聚集。

1 材料與方法

1.1材料 pATX2表達載體、HEK-293細胞株、HEK-TF無血清培養基、Lipo2000轉染試劑盒、膠回收試劑盒和糖苷酶PNGase F購自成都貝思迪生物有限公司；Ni-NTA 純化試劑盒購自Qiagen;鹽酸胍(GdnHCl)購自重慶衍慶生物；考馬斯亮藍 G-250、大分子擁擠試劑(BSA、Ficoll70、Dextran70、 PEG2000)和 Tris-HCl緩沖液均購自Sigma公司；PAS染色試劑盒(重慶葆光生物技術有限公司)；其他試劑均為國產分析純。實驗中用于蛋白質去折疊相關試劑配制的緩沖液均為10 mmol/L Tris-HCl(pH8.0)。

1.2方法

1.2.1重組黏蛋白MUC5AC的表達和純化 首先利用PCR技術選擇性擴增了含有兩個糖基化位點的基因片段Mucin-5AC[5500-5654]，得到的MUC5AC cDNA片段經EcoR Ⅰ和Not Ⅰ雙酶切后，再克隆入真核表達載體pATX2的兩酶切位點EcoR Ⅰ和Not Ⅰ之間，在c-末端加上His標簽，形成重組表達載體 MUC5AC-pATX2，并轉染至HEK293細胞內，在無血清培養基中培養并誘導目的蛋白表達。……