人工飼養黑葉猴糞便中三種常見菌群研究

郭愛霞 田明亮 李偉 仉偉 劉青 謝緒昌

人工飼養黑葉猴糞便中三種常見菌群研究

郭愛霞 田明亮 李偉 仉偉 劉青 謝緒昌

（濟南動物園服務中心 山東 濟南 250031）

本文采用平板活菌計數法，對濟南動物園13只健康黑葉猴糞便中大腸桿菌、梭菌、乳酸菌三種常見菌群進行了測定，以了解人工飼養下黑葉猴腸道正常菌群情況。結果表明：（1）在健康黑葉猴糞便中，大腸桿菌數量常用對數值平均為4.4，范圍在3.0-6.4；梭菌為5.6，范圍在3.0~6.8；乳酸菌為6.2，范圍在5.5~7.0。（2）每只試驗黑葉猴糞便中的菌群數量基本遵循乳酸菌>梭菌>大腸桿菌的規律。（3）健康黑葉猴糞便菌群中乳酸菌較大腸桿菌的優勢(即乳酸菌與大腸桿菌的比值)隨幼年、成年、老年的順序逐漸遞減，即隨年齡增大逐漸減小，數值分別為：幼年6.8/3.8(1.79)、成年6.1/4.3(1.42)、老年6.6/6.4(1.03))。兩者比值成年雌性大于成年雄性，分別為雌6.2/3.7(1.67)、雄6.6/4.7(1.40)。本文研究結果可作為不同年齡段健康黑葉猴腸道內正常菌群分布情況的參考，同時也為黑葉猴以至食葉猴類的腸道疾病的治療、微生物制劑的開發以及食葉猴類飼料配方的調整提供一定理論依據。

人工飼養 黑葉猴 糞便 三種常見菌群 腸道正常菌群

動物體表以及一切與外界相通的器官、組織和細胞，都生長著許多微生物種群，其與宿主長期共存，相互依賴，形成一個復雜的微生物生態系統。由于人們對這些正常微生物種群中的細菌和真菌研究較多，所以常稱之為正常菌群[1]。許多研究報告表明，正常菌群對機體的生長、發育、抗病、免疫及維持營養平衡等方面有著重要意義[2, 3]。目前，對人及動物的大量研究已經證實，菌群失調是某些疾病特別是腹瀉病的本質原因。

黑葉猴(Trachypithecus francoisi)是世界上珍貴稀有靈長類動物之一，屬于我國I級重點保護野生動物。在中國僅分布于廣西、貴州、重慶南部，主要棲息在熱帶雨林、季雨林、亞熱帶常綠闊葉林及石山灌叢，是生活在喀斯特石山的特有靈長類動物[4]。是以各種樹葉為主食的植物性猴類，樹葉約占食物總量的70%~90%[5]。黑葉猴胃腸道結構變得更加復雜，以適應發酵樹葉類粗纖維的功能。人工飼養下的黑葉猴由于異地飼養，受各地氣候影響，常綠樹葉數量和種類供應受限，其飼料配方也發生較大變化。籠養條件下黑葉猴胃腸道疾病的發病率較高，特別是對幼仔、未成年猴的威脅極大，死亡率較高，這與不清楚其胃腸道正常菌群和不能及時正確調整治療有密切關系。但迄今為止，由于野生動物取樣困難的特點，有關黑葉猴腸道正常菌群的研究，國內外仍缺乏系統報道，所以研究黑葉猴腸道正常菌群對診斷及防治黑葉猴的消化道疾病具有深刻意義，并為深入研究黑葉猴腸道微生態、消化生理、生態防治和科學的飼養管理提供依據，也為食葉靈長類的相關方面提供借鑒和參考。因此，我們對人工飼養的黑葉猴糞便正常菌群中三種常見菌進行了系統的定性、定量研究，用糞便中菌群值反映腸道菌群分布情況，為進一步探討腸菌群作用機制、合理開發利用腸菌群和生態制劑、防治胃腸道疾病提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物 選取13只健康、一周內未使用過抗生素的黑葉猴作為試驗動物，試驗動物按日常管理規范正常飼養。試驗動物情況見表1。

1.1.2 飼養管理 13只試驗黑葉猴，以家族為單位，分在3間相鄰館舍內飼養，以鋼絲勾花網相隔，館舍分為內舍和外活動場兩部分。白天在外活動場活動，晚上收到內舍休息。日糧配制以水果、蔬菜、樹葉為主，精料為輔；水果、蔬菜、精料定量供給；樹葉足量供給，讓其自由采食。館舍基本為封閉性結構，游客對黑葉猴的投喂幾乎沒有。試驗期間保持日常正常飼喂狀態。

表1 糞便中菌群測定試驗黑葉猴情況表

1.1.3 選擇性培養基 試驗所用3種選擇性培養基：大腸桿菌培養基(EMB)，強化梭菌培養基(RCM)，乳酸菌培養基(LBS)。三種培養基均為自制。

1.1.4 厭氧裝置 玻璃干燥缸。

1.2 方法

1.2.1 糞樣收集 采集黑葉猴新鮮正常糞便樣品，每次取樣2~5g。由專人觀察動物，觀察到試驗動物排便后，由與動物熟悉的飼養人員立即進入籠舍內取樣收集樣本，空氣中暴露不超過5min。無菌操作收集糞樣，在采樣袋上表明試驗動物名稱，放入冰袋中臨時保存，1~2h內冷鏈下轉移到實驗室。實驗室常規方法檢測糞樣中大腸桿菌、梭菌和乳酸菌數量，以lgN/g表示。每只試驗動物取在不同日期的糞便樣本3次，共取糞便36次樣。

1.2.2 樣本的稀釋 稱取樣本1.0g放入盛有9.0g的滅菌超純水中，震蕩混勻，以此為10-1做10倍遞進稀釋至10-9濃度。

1.2.3 糞便滴種和培養 吸取10-3~10-86個稀釋度菌液20μl分別接種于大腸桿菌、梭菌和乳酸菌培養基上，37℃培養24h后觀察大腸桿菌和梭菌菌落的生長情況。37℃厭氧培養48h后觀察乳酸菌菌落的生長情況。具體情況見表2。

表2 腸道正常菌群檢測所用培養基及培養方法

1.2.4 細菌鑒定 取菌落涂片，革蘭染色、鏡檢。根據選擇性培養基菌落的形態、大小、顏色、革蘭染色特性以及細菌的形態、大小、排列等特點鑒定細菌。

1.2.5 細菌計數 按照可數性原則對相同稀釋度的20μl滴樣品的菌落進行平板計數，求其平均值，根據稀釋度計算菌落數量，結果用每克糞便樣品所含的某種微生物數量(用N表示)的常用對數值表示，即lgN/g。

2 結果

菌群數量(見表3)。

表3 黑葉猴糞便中菌群數量常用對數值 (lgN/g)

3 討論

3.1 不同年齡段黑葉猴糞便中菌群不同

（1）健康黑葉猴正常糞便中大腸桿菌數量常用對數值平均為4.4，范圍在3.0-6.4，其中13號、10號、11號、4號動物的大腸桿菌數量常用對數值明顯比其它個體大；梭菌數量常用對數值平均為5.6，范圍在3.0~6.8，其中9號、8號、4號、3號動物的梭菌數量常用對數值明顯比其它個體小；乳酸菌數量常用對數值平均為6.2，范圍在5.5~7.0。（2）每只試驗黑葉猴糞便中的菌群數量基本遵循乳酸菌>梭菌>大腸桿菌的規律。（3）健康黑葉猴糞便菌群中乳酸菌較大腸桿菌的優勢(即乳酸菌與大腸桿菌的比值)隨幼年、成年、老年的順序逐漸遞減，即隨年齡增大逐漸減小，數值分別為：幼年6.8/3.8(1.79)、成年6.1/4.3(1.42)、老年6.6/6.4(1.03))。兩者比值成年雌性大于成年雄性，分別為雌6.2/3.7(1.67)、雄6.6/4.7(1.40)。亞成年階段乳酸菌與大腸桿菌的比值為5.6/5.1 (1.10)，乳酸菌較大腸桿菌優勢不明顯，僅高于老年個體。

3.2 與文獻報道中菌群數量的比較

表4 幾種靈長類動物糞便中三種常見菌數量對比(lgN/g)

注1:梭菌數量僅包括cluster XIVa和梭菌cluster IV

查找不同靈長類動物糞便中菌群數量研究的文獻，整理數據見表4。（1）從表4得出，黑葉猴糞便中大腸桿菌數量明顯低于金絲猴和獼猴，與人相近；乳酸菌數量在四種動物中最少；梭菌數量明顯少于金絲猴。（2）本試驗中黑葉猴糞便中的大腸桿菌、梭菌和乳酸菌數量均高于在本試驗的微生物實驗室中曾經檢測過的豬、雞等12種家畜、家禽的糞便中菌群數量。（3）哺乳動物按食性可分為草食性動物、雜食性動物、肉食性動物，其腸道菌群組成也與其食性有密切關系。本試驗動物黑葉猴與金絲猴都屬于主要以葉類為食的猴類，其胃呈囊狀，具有較為發達的盲腸，腸道內容物中擁有大量微生物對食物進行發酵。從表4可知，金絲猴的三種常見菌數量均明顯高于其它動物，是其對葉類食性的反映。但本試驗動物黑葉猴三種常見菌數量明顯低于金絲猴，這應該與人工飼喂的食物種類與野外相比發生較大改變有關：本試驗動物異地飼養于中國北方地區，常綠樹葉數量和種類供應受限，動物食物以水果、蔬菜為主，精料、樹葉為輔，其胃腸道適應了食物的改變，使腸道內消化纖維的微生物數量降低，這可能是造成其糞便中菌群數量均較少的原因。（4）研究發現，大腸桿菌感染是引起黑葉猴腹瀉的主要原因之一。乳酸菌和大腸桿菌被認為是指示腸道健康的主要菌群，消化道中乳酸菌與大腸桿菌的比值可作為檢測腸道菌群平衡的指示指標，乳酸菌數量高于大腸桿菌數量能夠促進有益菌對腸道病原菌抑制作用的發揮。在本試驗中，黑葉猴的腸道內以乳酸菌為典型代表的有益菌占據了優勢地位，這也說明黑葉猴能夠適應低纖維食物并維持正常腸道菌群環境。（5）黑葉猴為珍貴瀕危野生動物，可獲得試驗動物數量受限，其次野生動物的特性使取樣異常困難，樣本數量偏少，因此本試驗數據具有一定的局限性。

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（2019–09–20）

S826.9+9

A

1007-1733(2019)12-0032-03