非洲豬瘟國內(nèi)流行現(xiàn)狀及診斷、防控

周仁江 楊治聰 黃先奇 沈愛梅 葉鵬 曹昕 郭莉 侯巍 陽愛國 莫茜 尹杰 袁東波 魯志平 郭萬里 曾子鑫

非洲豬瘟國內(nèi)流行現(xiàn)狀及診斷、防控

周仁江①楊治聰①黃先奇②沈愛梅②葉鵬②曹昕②郭莉③侯?、坳枑蹏勰纰垡堍墼瑬|波③魯志平④郭萬里⑤曾子鑫⑥

（①四川省青神縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 620460 ②四川省眉山市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 ③四川省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 四川 成都 ④成都農(nóng)業(yè)科技職業(yè)學(xué)院 四川 成都 ⑤四川省茂縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 ⑥四川省南充市嘉陵區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心）

非洲豬瘟(African swine fever, 簡稱ASF)是由非洲豬瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)引起豬的一種急性、高度致死性傳染病。自2018 年8 月中國首例非洲豬瘟案例以來，短短數(shù)月，已席卷了全國31個(gè)省份，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的損失，形勢異常嚴(yán)峻，因此開展非洲豬瘟診斷工作、病毒基礎(chǔ)研究工作至關(guān)重要。本文分析了非洲豬瘟流行現(xiàn)狀，并綜述了研究學(xué)者在非洲豬瘟各種診斷技術(shù)、病毒基礎(chǔ)研究、綜合防控等方面的研究進(jìn)展，對(duì)加強(qiáng)我國非洲豬瘟診斷技術(shù)的儲(chǔ)備與制定非洲豬瘟防控措施提供參考。

ASF臨床上以豬高熱、食欲廢絕、皮膚發(fā)紺、內(nèi)臟實(shí)質(zhì)器官出血、呼吸系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂為主要特征，易感豬群的病死率高達(dá)100%。是一種嚴(yán)重的“世界經(jīng)濟(jì)”動(dòng)物疫病，被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)列為法定報(bào)告動(dòng)物疫病，在我國被列為一類動(dòng)物疫病。ASFV不感染人，對(duì)人的健康不構(gòu)成威脅。目前，針對(duì)ASF防控，尚無有效的商品化疫苗和治療方法。

1 ASF流行與危害

2018年8月3號(hào)，中國動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心診斷首次報(bào)道我國出現(xiàn)非洲豬瘟病例，截至今年8月26日，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部通報(bào)通報(bào)疫情152起，涉及全國31個(gè)省(市、區(qū))，其中野豬3起，家豬149起；共解除封鎖148起，解除疫情省份28個(gè)；今年將近7個(gè)月的時(shí)間里，發(fā)生疫情53起。

表1 全國非洲豬瘟疫情形勢

2 病原學(xué)特征

2.1 基因組龐大，易變異

非洲豬瘟病毒(ASFV)，屬于非洲豬瘟病毒科非洲豬瘟病毒屬，雙股DNA，是唯一核酸為DNA的蟲媒病毒，基因組長度約為170~193kb，是藍(lán)耳病病毒的12倍，豬瘟病毒的15倍，口蹄疫病毒的24倍。其中基因組結(jié)構(gòu)主要包含約125kb的中央保守區(qū)、38~47kb的左側(cè)可變區(qū)和13~16kb的右側(cè)可變區(qū)，基因組變異非常頻繁，根據(jù)B646L基因的相似性，可以將ASFV分成24個(gè)不同的基因型，進(jìn)一步根據(jù)P54和PB602L基因的中央可變區(qū)(CVR)序列，ASFV 的分型數(shù)量會(huì)更多。

附圖 基于ASFV B646L 基因的 24個(gè)基因型

2.2 存活時(shí)間長，抵抗力強(qiáng)

ASFV個(gè)體較大，直徑200nm，表面為正二十面體和一層含類脂囊膜的對(duì)稱結(jié)構(gòu)病毒，因此高溫和一些破壞囊膜的消毒劑均可有效殺滅ASFV。但是由于其復(fù)雜的分子結(jié)構(gòu)，ASFV對(duì)消毒劑的抵抗力較其他的囊膜病毒稍強(qiáng)，特別是在一些豬肉制品或血液中存活時(shí)間更長。在血液、糞便和組織中可長期存活，凍肉中存活數(shù)年甚至數(shù)十年。廣東省首例非洲豬瘟，疫點(diǎn)消毒7d后環(huán)境樣品仍然能檢測到病毒核酸。

表2 ASFV與FMDV耐受性

3 ASF的診斷

目前尚無針對(duì)ASF有效的治療方法和疫苗，因此迫切需要快速的ASF檢測及防控技術(shù)，以及時(shí)發(fā)現(xiàn)ASFV感染豬并及時(shí)撲滅疫情。目前，ASFV的檢測技術(shù)主要有針對(duì)病毒DNA的核酸檢測技術(shù)和基于病毒抗體反應(yīng)的免疫學(xué)技術(shù)兩大類。

3.1 ASF臨床癥狀和病理變化

臨床癥狀與病毒的毒力、感染的劑量和途徑有關(guān)，可分為最急性型、急性型、亞急性型和慢性型。最急性型無明顯癥狀，突發(fā)高熱后迅速死亡。急性型、亞急性型的病理剖解變化較明顯，主要的病變器官為脾臟、淋巴結(jié)、腎臟和心臟。脾臟顯著腫大(一般情況下是正常脾的3~6倍，顏色變暗，質(zhì)地變脆，脾臟的變化是一種典型的病理變化)；淋巴結(jié)腫大、出血、變脆，有時(shí)血腫呈黑紅色，切面呈大理石樣；腎皮質(zhì)和腎盂切面有點(diǎn)狀出血；心臟斑點(diǎn)狀出血，心包積液帶有血液。慢性型主要發(fā)生于非洲野豬，感染豬幾無臨床癥狀。

3.2 血清學(xué)檢測方法

3.2.1 紅細(xì)胞吸附試驗(yàn) HAD是ASF的確診方法之一，通過用豬的血液或組織懸液接種原代白細(xì)胞培養(yǎng)物或制備感染豬血液白細(xì)胞培養(yǎng)物完成相應(yīng)檢測，鏡檢出現(xiàn)紅細(xì)胞吸附在感染細(xì)胞的表面，呈現(xiàn)玫瑰花環(huán)或桑葚狀現(xiàn)象，可判定為陽性。HAD需要觀察的時(shí)間取決于病料中病毒的含量，通常需要3~10ｄ，有個(gè)別ASFV毒株沒有紅細(xì)胞吸附能力，因此目前逐步被PCR所代替。

3.2.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA) 目前國內(nèi)外常用作檢測抗原的蛋白有VP73、VP72、P54等。ASFV感染豬7d左右即可檢出IgM和IgG，并且IgG在感染豬體內(nèi)能存在數(shù)年。目前以VP73蛋白、VP72蛋白、P54蛋白的商品化ELISA試劑盒被廣泛應(yīng)用，抗體檢測試劑盒有ASF阻斷ELISA試劑盒(Ingenasa，西班牙)等，抗原檢測試劑盒有ELISA EZIM K3試劑盒(Ingenasa，西班牙)。

3.2.3 膠體金免疫層析(GICA)試紙條 膠體金免疫層析技術(shù)是適合基層現(xiàn)場快速診斷和流行病學(xué)調(diào)查的一項(xiàng)檢測技術(shù)。張鑫宇等原核表達(dá)Ｐ54重組蛋白，制作ASFV P54抗體檢測膠體金免疫層析試紙，具有特異性強(qiáng)、敏感性高等特點(diǎn)。劉波(2014)也運(yùn)用原核表達(dá)系統(tǒng)和膠體金免疫層析技術(shù)，對(duì)ASFV快速檢測試紙條的技術(shù)進(jìn)行了研究。吳海濤(2018)運(yùn)用雙抗體夾心法原理純化后的抗ASFV單克隆抗體制備金標(biāo)抗體，制備了用于檢測ASFV的膠體金免疫層析試紙條。

3.2.4 其他血清學(xué)方法 熒光抗體試驗(yàn)(FAT)可以用作ASFV抗原檢測的一種輔助方法，可用于檢測野外可疑豬或?qū)嶒?yàn)室接種豬的脾、淋巴結(jié)等組織中的抗原，也可以鑒定無紅細(xì)胞吸附能力的毒株。該方法具有快速、經(jīng)濟(jì)、敏感性和特異性高等優(yōu)點(diǎn)，但需要專業(yè)試驗(yàn)人員，同時(shí)需要熒光顯微鏡及高質(zhì)量的熒光標(biāo)記抗體。因此僅作為ASFV的輔助檢測方法。間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA) 可用于檢測感染ASFV的豬血清樣品。該方法的優(yōu)點(diǎn)是當(dāng)ELISA檢測結(jié)果不確定或制備抗原困難或復(fù)雜時(shí)，可選用此法。免疫組化法是通用的檢測方法之一，但對(duì)于臨床癥狀不明顯的病例，確診有一定難度，因此，該方法僅作為ASFV的輔助檢測方法。免疫印跡檢測(immuno-blotting test)是將蛋白質(zhì)電泳技術(shù)與血清學(xué)相結(jié)合的一種免疫生化技術(shù)，該方法特異性高，能簡單客觀的判定結(jié)果，能識(shí)別出弱陽性結(jié)果，可作為IFA替代方案對(duì)個(gè)別不確定結(jié)果進(jìn)行確證。

3.3 分子生物學(xué)檢測方法

3.3.1 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR) PCR具有簡單快速、靈敏度高和特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，是目前ASFV最常用的實(shí)驗(yàn)室檢測方法。Aguero等(2003)和曾少靈等(2009)先后根據(jù)ASFV VP72基因建立了ASFV的PCR檢測方法，均具有良好的敏感性和特異性，為ASFV早期感染的快速診斷提供了有效的分子生物學(xué)檢測方法。崔尚金等(2012)建立了ASFV的高效納米PCR檢測方法，采用納米金顆粒作為熱導(dǎo)介子，提高了PCR反應(yīng)效率。

3.3.2 熒光定量PCR 實(shí)時(shí)熒光定量PCR比常規(guī) PCR具有更高的敏感性和特異性，可同時(shí)快速檢測大批量樣品。Fernandez等(2013)利用通用探針庫建立了ASFV的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法。王建華等(2016)根據(jù)ASFV CP530R基因和高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒NSP2基因?yàn)榘行蛄?，建立了可同時(shí)鑒別檢測ASFV和PRRSV的二重TaqMan熒光定量RT-PCR方法。崔貝貝等(2019)根據(jù)E184L基因建立了快速檢測ASFV的TaqMan熒光定量PCR方法，方法能快速、準(zhǔn)確、特異、靈敏地對(duì)ASFV核酸進(jìn)行定量分析，且與偽狂犬病病毒、豬細(xì)小病毒、豬圓環(huán)病毒２型等多種病原不存在交叉反應(yīng)。

3.3.3 重組酶聚合酶擴(kuò)增(RPA)技術(shù) RPA是一種可以替代傳統(tǒng)PCR的新型核酸檢測技術(shù)，該方法操作簡單、反應(yīng)快速、檢測成本低、結(jié)果確實(shí)可靠。王建昌等(2016)基于ASFV VP72基因保守序列設(shè)計(jì)并合成引物，建立了ASFV RPA等溫檢測方法，為ASFV的一線防控提供了一種新的、可靠的技術(shù)支持。吳映彤等(2018)基于ASFV多基因家族成員MGF360-12L基因序列，建立重組酶聚合酶擴(kuò)增(RPA)等溫檢測方法，該方法操作簡單、反應(yīng)快速、檢測成本低，為ASFV相關(guān)基因缺失毒株的鑒別診斷提供一定技術(shù)支持。

3.3.4 線性指數(shù)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LATE-PCR)技術(shù) LATE-PCR是不對(duì)稱PCR的一種形式，該方法用于檢測組織樣品的病毒，其敏感性可以達(dá)到大約1拷貝的病毒DNA。Ronish等(2011)基于ASFV VP72基因建立了LATE-PCR方法，為ASFV的實(shí)驗(yàn)室診斷提供了敏感的檢測方法。

3.3.5 環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增(LAMP)技術(shù) LAMP 技術(shù)操作簡單、靈敏、快速，檢測成本遠(yuǎn)低于熒光定量PCR，且不需要特殊儀器設(shè)備，具有較高的臨床實(shí)用性。JAMES等針對(duì)ASFV拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ基因建立了一步法檢測ASFV的LAMPs方法，最低可以檢測到330拷貝DNA的病毒。國內(nèi)學(xué)者均根據(jù)ASFV Ｐ72基因建立了ASF LAMPs檢測方法，特異性良好，與常規(guī)PCR比靈敏度高，可用于ASF快速檢測。鄔旭龍(2014)根據(jù)ASFV K205R基因序列設(shè)計(jì)引物，建立了LAMP檢測方法。

3.3.6 探針雜交技術(shù) 張鑫宇等(2011)針對(duì)ASFV VP72基因建立了納米金探針雜交方法。探針雜交技術(shù)檢測靈敏度高，能有效排除PCR檢測過程中的非特異性結(jié)果，省去了瓊脂糖凝膠電泳步驟，操作簡便、檢測迅速，在酶標(biāo)板中可批量反應(yīng)，為ASFV核酸檢測方法開辟了新的途徑，但該方法的建立難度較高、操作較繁瑣，對(duì)試驗(yàn)人員技術(shù)水平要求較高。

3.3.7 原位雜交 原位雜交(insituhybridization，ISH)是將標(biāo)記的核酸探針與組織細(xì)胞中待檢核酸特異結(jié)合，再用檢測系統(tǒng)檢測標(biāo)記探針，同時(shí)顯示核酸所在的位置。BALLESTER等使用ISH技術(shù)，用地高辛標(biāo)記的探針檢測福爾馬林固定、石蠟包埋組織中的ASFV DNA，并取得較好的檢測效果。

4 ASF的防控

4.1 政府應(yīng)充分發(fā)揮自身主導(dǎo)作用，強(qiáng)制落實(shí)有效的ASF防控政策

4.1.1 向社會(huì)公眾普及ASF危害性，動(dòng)員公眾參與到ASF疫情防控中 做好ASF的社會(huì)科普工作，向全社會(huì)普及其危害，重點(diǎn)做好農(nóng)村宣傳工作，及時(shí)且合理的補(bǔ)貼生豬養(yǎng)殖者的損失，引導(dǎo)生豬養(yǎng)殖經(jīng)營等重點(diǎn)環(huán)節(jié)從業(yè)者積極主動(dòng)參與到ASF防控行動(dòng)中，形成全民參與的ASF防控統(tǒng)一戰(zhàn)線。

4.1.2 加大ASF疫情防控技術(shù)投入與創(chuàng)新，為ASF防控提供的技術(shù)支持 ASF疫情防控技術(shù)主要包括快速診斷、防控技術(shù)、疫苗研究等。由于非洲豬瘟病毒擁有龐大的基因組結(jié)構(gòu)和復(fù)雜的免疫逃逸機(jī)制，使得目前全世界范圍內(nèi)尚無商品化安全有效的疫苗。專業(yè)領(lǐng)域的科研機(jī)構(gòu)，要發(fā)揮科技人才優(yōu)勢，把疫苗研發(fā)作為戰(zhàn)略性科技攻關(guān)項(xiàng)目來推動(dòng)，力爭盡早取得突破，為我國ASF疫情的有效防控提供重要科學(xué)依據(jù)，為檢測技術(shù)和防治疫苗研發(fā)奠定了重要基礎(chǔ)。

4.2 生豬養(yǎng)殖經(jīng)營等重點(diǎn)環(huán)節(jié)從業(yè)者應(yīng)發(fā)揮自身主體作用，積極配合政府的防疫工作

4.2.1 生豬養(yǎng)殖場(戶)積極配合政府的疫情管理工作，做好豬場生物安全制度 養(yǎng)殖場(戶)應(yīng)積極配合政府的疫情管理工作，主動(dòng)了解ASF防控知識(shí)，提高對(duì)ASF疫情的甄別能力與應(yīng)急能力。目前，豬場生物安全已成為養(yǎng)殖場(戶)存活的關(guān)鍵所在，也是豬場防控非洲豬瘟唯一措施。按規(guī)定申報(bào)檢疫，減少場外人員和車輛進(jìn)入豬場，重點(diǎn)是做好豬群飼養(yǎng)管理，對(duì)豬群實(shí)施全進(jìn)全出飼養(yǎng)管理，不散放飼養(yǎng)，避免家豬與野豬接觸，提高飼養(yǎng)的生物安全水平。同時(shí)堅(jiān)決不使用泔水或餐廚垃圾喂豬，切斷飼養(yǎng)過程中一切可能的疫情傳播途徑，積極配合獸醫(yī)人員做好每日排查工作。

4.2.2 生豬經(jīng)營重點(diǎn)環(huán)節(jié)從業(yè)者，不進(jìn)行違法生豬交易行為 我國新聞報(bào)道已頻繁揭露了許多不法分子“洗豬”、“炒豬”等違法交易行為，違法經(jīng)營行為直接造成了染疫豬只及產(chǎn)品在全國各地的流通，加速了ASF在我國的擴(kuò)散。生豬養(yǎng)殖、運(yùn)銷、屠宰、市場等重點(diǎn)環(huán)節(jié)從業(yè)人員應(yīng)加強(qiáng)動(dòng)物防疫法律的學(xué)習(xí)，樹立動(dòng)物防疫法律意識(shí)，遵守法律對(duì)生豬行業(yè)從業(yè)人員的規(guī)定與要求，時(shí)刻用不法分子承受的嚴(yán)重代價(jià)來警醒自己，發(fā)現(xiàn)可疑情況及時(shí)上報(bào)，不要隱瞞疫情，不給生豬交易過程中的人員創(chuàng)造違規(guī)操作的空間。

5 小結(jié)

（1）ASF作為一種重要的動(dòng)物疫病，其病原結(jié)構(gòu)和流行病學(xué)復(fù)雜，具有傳染性強(qiáng)、死亡率高、缺少有效的疫苗預(yù)防等特征。在我國的《國家中長期動(dòng)物疫病防治規(guī)劃(2012-2020)》中，ASF被列為優(yōu)先防范的13種重大外來動(dòng)物疫病之一。從2018年8月3日以來，我國已有31個(gè)省(市、區(qū))相繼發(fā)生該疫情，目前非洲豬瘟疫情對(duì)我國養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重威脅。因此，開展對(duì)ASF的相關(guān)研究，尤其是病原學(xué)、流行病學(xué)、診斷技術(shù)和疫苗等，將為ASF的防控奠定理論基礎(chǔ)。（2）ASFV的實(shí)驗(yàn)室檢測方法多種多樣，各有優(yōu)缺點(diǎn)，但對(duì)各種方法的檢測結(jié)果均要求準(zhǔn)確、快速、敏感，這不僅對(duì)感染ASFV的動(dòng)物治療非常重要，而且對(duì)未感染的動(dòng)物及時(shí)采取有效的預(yù)防措施同樣具有重要的意義。OIE推薦檢測方法主要有PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、ELISA等。用免疫學(xué)方法檢測抗體可以了解ASFV感染、發(fā)生、發(fā)展的進(jìn)程，但抗體只有在病毒感染至一定時(shí)期后才會(huì)出現(xiàn)，故ELISA等抗體檢測方法在病毒早期監(jiān)測工作中存在一定的局限性。PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、LAMP 等分子生物學(xué)技術(shù)在豬感染ASFV的早期即可檢測到病毒核酸，在早期檢測中具有重要作用。目前，動(dòng)物疫病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)多采用經(jīng)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部批準(zhǔn)、由青島立見診斷技術(shù)發(fā)展中心生產(chǎn)的非洲豬瘟病毒熒光定量PCR檢測試劑。（3）過去的幾十年中，ASFV疫苗的研究雖取得了較大進(jìn)展，包括評(píng)估細(xì)胞傳代致弱、自然致弱、基因缺失等ASFV疫苗，但是暫時(shí)都還未研制出可應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)的疫苗。通過基因重組技術(shù)，獲得安全、高效ASFV減毒活疫苗仍是ASFV疫苗開發(fā)的首選策略。然而，仍有一些問題需要考慮，主要包括疫苗產(chǎn)生具備中和ASFV抗體，在體內(nèi)的安全性研究，鑒別野毒感染和疫苗免疫，以及鑒定并開發(fā)適合弱毒活疫苗生產(chǎn)的細(xì)胞系等。今年4月，哈爾濱獸醫(yī)研究所申請(qǐng)了基因缺失的減毒非洲豬瘟病毒及其作為疫苗的應(yīng)用專利，但安全有效的疫苗要從實(shí)驗(yàn)室研究到大規(guī)模商業(yè)化量產(chǎn)，還有很長一段路要走。（4）ASF的暴發(fā)對(duì)我國養(yǎng)殖業(yè)既是空前的挑戰(zhàn)，又將對(duì)我國養(yǎng)豬業(yè)及相關(guān)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響。截至2019年7月3日，中國31 個(gè)省(市、區(qū))共發(fā)生143起ASF疫情，據(jù)報(bào)道大約有116萬余頭豬被撲殺以阻止疫情的傳播。ASF疫情勢必打擊部分養(yǎng)豬從業(yè)者的養(yǎng)殖信心和補(bǔ)欄意愿，但對(duì)于重塑我國養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)格局、重新布局養(yǎng)豬業(yè)區(qū)域、改變現(xiàn)有落后的養(yǎng)豬模式、提高養(yǎng)殖戶生物安全意識(shí)、終結(jié)泔水養(yǎng)豬、升級(jí)生豬調(diào)運(yùn)裝備等都有積極的推動(dòng)作用。

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