兩種抗凝劑對禽白血病分離培養影響評價

薛曉陽

兩種抗凝劑對禽白血病分離培養影響評價

薛曉陽

（華裕農業科技有限公司 河北邯鄲 056000 河北省蛋雞產業技術研究院 河北省蛋雞繁育技術創新中心）

本試驗比較兩種抗凝管(一次性肝素鈉抗凝管和一次性EDTA-K2抗凝管)使用效果。使用兩種抗凝管采集相同6只公雞全血，樣品進行1500-2000r離心2min，取中間靠下層接種DF-1細胞，使用6孔細胞培養板，待細胞生長密度接近90%時每孔接種處理好的樣品90μl，每孔加入過濾的肝素鈉抗凝劑20ul(12.5U/ml)。同時設立陰性對照，觀察接種后5min和2h細胞狀態。結果發現，2h一次性EDTA-K2抗凝管發生細胞上清液發生凝集，一次性肝素鈉采集樣品狀態良好，未發生凝集。結論：一次性肝素鈉抗凝管適合白血病病毒分離采樣工作

禽白血病，抗凝管，凝集

禽白血病(A vianleukosis virus，ALV)的傳播方式分為垂直傳播及水平傳播，其中經卵垂直傳播是禽白血病的主要傳播方式，家禽感染禽白血病后可造成雞只生長發育遲緩、產蛋性能下降、免疫抑制等影響[1]。并且禽白血病可以發生垂傳，種雞生產企業尤其重視，會定期進行白血病凈化檢測，在雞群中可分離到的禽白血病病毒分別屬于A、B、C、D、E和J六個亞群，A、B、C、D和J亞群是外源性的白血病病毒，而E 亞群則主要以前病毒的形式存在于宿主基因組中而廣泛存在[2]，由ALV-J引發的腫瘤、血管瘤給中國養雞業帶來了很大的危害，崔治中老師在過去十多年里，總結全國報道了100多個ALV-J毒株的分離鑒定[3]，白血病病毒分離中可以使用DF-1細胞，其是一種可傳代的雞成纖維細胞系。而在白血病的分離培養中DF-1來源于ELL雞胚胎，該細胞無禽白血病病毒，肉瘤病毒內源性基因，同時在形態上呈纖維狀。DF-1細胞系是一種穩定的、無腫瘤基因、自發無限增值的細胞系。目前被廣泛用于動物病毒研究、疫苗研制、癌癥研究等諸多領域。是生命科學領域重要的病毒轉染、培養生物材料[4]。目前禽白血病病毒分離樣品通常采取抗凝血，抗凝管市場可以買到的多為肝素鈉抗凝管和EDTA-K2抗凝管，本試驗就兩種抗凝管的使用效果進行比較，同時對其作用機理進行查找。

1 材料與方法

1 試驗材料

1.1.1 DF-1細胞 山東農業大學腫瘤與免疫抑制病實驗室惠贈。肝素鈉抗凝管購自江蘇宇力醫療器械有限公司，EDTA-K2抗凝管購自山東省成武縣醫用制品廠。6孔細胞培養板購自美國康寧公司。DMEM高糖培養基生產廠家gibco，產品貨號8119159，有效期至2020.5。0.25胰酶，生產廠家gibco，產品貨號2008319，有效期至2020.9.30。青鏈霉素生產廠家gibco，產品貨號2068817, 2020.1.30。兩性霉素B生產廠家procell，有效期至2020.6。胎牛血清：PAA品牌，生產日期SF181212。

1.1.2 實驗設備 二氧化碳培養箱(品牌松下，型號MCO-18AC)、倒置顯微鏡(品牌NIKON，型號TS2)、高壓滅菌鍋(博訊品牌，型號YXQ-LS-50SII)、超純水系統(艾科浦公司生產，型號：AWL-0501-H)、電熱干燥箱(上海博訊生產，型號GZX-9140MBE)、超凈工作臺(上海博訊公司生產，型號SW-CT-LFD)、醫用離心機(湘儀設備，型號H1850)。

1.1.3 試驗動物 健康狀況良好的海蘭褐公雞6只，日齡310d。

1.2 方法

1.2.1 試劑配制 參照山東農業大學腫瘤與免疫抑制病實驗室方法，具體如下：配制10%細胞培養液：所需物品放入超凈臺，紫外線照射30min，生長液配置為：88% DMEM培養基+10%胎牛血清(FBS)+1ml商品雙抗(100IU/ml)+1ml商品兩性霉素B(2.5ug/ml)，維持液配置為：96% DMEM培養基+2%胎牛血清(FBS)+1ml商品雙抗(100IU/ml)+1ml商品兩性霉素B(2.5μg/ml)，最終經0.22μm濾器過濾除菌，標明培養基相關信息。

1.2.2 抗凝血采集 使用一次性肝素鈉抗凝管、一次性EDTA-K2抗凝管同時采集同1只公雞各一管，共采集6只公雞。

1.2.3 樣品接種 參照山東農業大學腫瘤與免疫抑制病實驗室方法，具體如下：（1）抗凝血：1500~2000r離心2min，取中間靠下層，注意不要取到紅細胞.本試驗使用6孔細胞培養板，待細胞生長密度接近90%時每孔接種接90μl樣品，每孔加入過濾的肝素鈉抗凝劑20μl(12.5U/ml)。（2）接種完樣品后2h后觀察細胞狀態，觀察是否發生上清液凝集。（3）同時設置2個陰性對照，為不接種樣品直接添加肝素鈉抗凝劑20μl(12.5U/ml)。

2 試驗結果

2.1 5min后不同采樣管樣品接種后細胞

使用一次性EDTA-K2抗凝管采樣接種DF-1細胞5min后細胞出現類似胰酶消化現象，細胞變圓，失去成纖維狀態。一次性肝素鈉抗凝管采樣接種DF-1細胞5min后，細胞狀態良好，維持貼壁狀態，對照細胞生長良好，呈現纖維狀，符合成纖維細胞特性。

2.2 2h后不同采樣管樣品接種后細胞

使用一次性EDTA-K2抗凝管采樣接種DF-1細胞5min后細胞呈貼壁生長狀態，符合成纖維細胞狀態，但是細胞上清液出現凝集狀態。一次性肝素鈉抗凝管采樣接種DF-1細胞5min后，細胞狀態良好，維持貼壁狀態，對照細胞生長良好，呈現纖維狀，符合成纖維細胞特性，并且一次性肝素鈉接種樣品和對照細胞上清液均沒有出現凝集現象。

2.3 兩種采樣管采樣接種細胞后上清液發生凝集情況 (見附表)

3 討論

肝素鈉具有帶強負電荷的理化特性，能干擾血凝過程的許多環節，在體內外都有抗凝血作用。其作用機制比較復雜，主要通過與抗凝血酶III(AT-III)結合，而增強后者對活化的IIa、IXa、Xa、XIa和XIIa凝血因子的抑制作用。乙二胺四乙酸(EDTA)鹽EDTA有二鈉、二鉀和三鉀鹽。均可與鈣離子結合成螯合物，從而阻止血液凝固。這也是此次試驗的選擇的抗凝管原理，但是此次試驗結論一次性EDTA-K2抗凝管采血樣品，樣品處理后接種DF-1細胞，再添加肝素鈉抗凝，結果仍發生上清凝集，而一次性肝素鈉采血管采血后樣品進行處理后接種DF-1細胞，再添加肝素鈉抗凝，結果上清未發生凝集。此原理尚不清楚，后續繼續跟蹤，也希望相關報到進行討論。但最終結論一次性肝素鈉抗凝管適合白血病病毒分離采樣工作。

附表 兩種采樣管接種細胞后上清液凝集情況

項目樣品數目接種后細胞上清液凝集數目凝集率 一次性EDTA-K2抗凝管66100% 一次性肝素鈉抗凝管600% 對照200%

4 結論

一次性肝素鈉抗凝管采全血處理后接種DF-1細胞，加20μl(12.5U/ml)肝素鈉抗凝劑。抗凝劑后細胞狀態良好，2h候后觀察狀態較為良好，細胞上清液未發生凝集，比較適用于禽白血病病毒分離。

[1] 許玉靜, 李翀, 韋景平等. 禽白血病P27抗原檢測樣品采集及處理要點[J]. 今日畜牧獸醫, 2019. 7: 12.

[2] C alnek B W, B arnes H J, B eard C W, et al. D isease ofPoultry[M]. A m es: Iow a state U niversity Press, 1997.

[3] 徐鑌蕊, 董衛星, 余春明等. 蛋雞J亞群禽白血病的分子生物學診斷[J]. 病毒學報, 2005, 21(4): 289-292.

[4] 蓋麗麗, 張莉, 姜世金等. 三種花色苷對df-1細胞的影響[J]. 生物技術通訊, 2012, 23(4): 542-546.

（2019–10–08）

創新團隊，項目編號189A6612H

S816.75

A

1007-1733(2019)12-0026-02