K亞群禽白血病病毒多克隆檢測抗體的制備和特性分析

王呈呈 冉英 肖雅之 李涵 胡衛國 邱建華 李宏梅 郭慧君

試驗研究

K亞群禽白血病病毒多克隆檢測抗體的制備和特性分析

王呈呈?冉英?肖雅之?李涵 胡衛國 邱建華 李宏梅*郭慧君*

（山東農業大學動物科技學院，山東省動物生物工程與疾病防治重點實驗室 山東 泰安 271018）

為制備識別Ｋ亞群禽白血病病毒(ALV-K)兔源多克隆抗體，將含ALV-K gp85基因的表達質粒在大腸桿菌體內進行誘導表達，獲得含his標簽的大小為55KD的重組蛋白；將純化后的表達蛋白免疫接種5只青年兔，三次加強免疫后檢測收獲血清抗體，ELISA檢測血清抗體效價；對血清抗體進行純化并檢測抗體亞型，Western-blot和IFA檢測抗體對ALV-Kgp85蛋白和病毒識別特性。結果表明，獲得的抗體效價達到8×107，抗體亞型為IgG2b, 該抗體能夠特異性識別ALV-K gp85蛋白和DF1細胞中的ALV-K病毒，可以用于IFA臨床檢測，為K亞群禽白血病的快速檢測奠定了基礎。

K亞群禽白血病病毒 gp85基因 間接免疫熒光試驗(IFA) 多克隆抗體

禽白血病毒(avian leukosis viruse, ALV)是反轉錄病毒科、腫瘤病毒亞科的一員。根據ALV在囊膜-受體決定簇、宿主范圍、基因組特征、病毒干擾試驗等方面的差異，ALV被劃分為11個亞群，依次命名為A~ K亞群[1, 2]。K亞群禽白血病病毒(ALV-K)是近幾年新發現的禽白血病病毒亞群，在我國地方雞群中流行相當廣泛[2, 3]。初步的研究表明，近些年來，ALV-K在我國的檢出率呈上升趨勢，且可能在我國多個地方雞種中長期存在，其病毒特性與傳統的外源性ALV有很大不同，缺乏對ALV-K的診斷試劑和方法，給臨床上ALV-K的鑒別診斷帶來較大困難[4-6]。

本研究通過利用大腸桿菌表達的ALV-K gp85蛋白免疫兔，獲得高效價的多克隆抗體，對抗體的亞群和識別特性進行分析，為ALV-K的臨床診斷提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

毒株ALV-K-JS11C1由崔治中教授惠贈；含ALV-K gp85基因的陽性重組表達質粒(菌種)由實驗室制備；DF-1細胞由本實驗保存；弗氏佐劑、FITC標記的羊抗雞二抗、FITC標記羊抗鼠熒光二抗、PEG-1500、HT、HAT、秋水仙素、單克隆抗體亞類鑒定試劑盒，購自Sigma公司；健康成年新西蘭公兔購自泰安某種兔場。

1.2 方法

1.2.1 重組gp85蛋白在大腸桿菌中的表達 復蘇含有ALV-Kgp85基因的BL21菌液15~30μl放入含Amp+100μg/ml抗性的5ml LB液體培養基中37℃震蕩過夜培養，次日按1:50或1:100比例接種于500ml液體培養基，37℃，2200rpm，約2~3h測OD600約為0.6，取出1ml未誘導的菌液做對照，加入IPTG使其終濃度為1mmol/ml，37℃繼續振搖培養4h，取1ml菌液，離心收集沉淀?

1.2.2 蛋白電泳 按說明書制膠，1.5mm膠板，下層膠12%，上層膠5%。樣品處理：1ml菌液12000rpm離心10min棄上清，沉淀用20μl的PBS重懸，加入5×上樣緩沖液5μl，沸水浴10min后12000r/min離心10min。10μl每孔，設蛋白質標準分子量做對照，打開電源。70v電壓約1h，溴酚藍帶估計進入分離膠，電壓至90v，溴酚藍帶到達分離膠底部停止電泳。染色：取下凝膠，將其浸泡于考馬斯亮藍R-250，至于水平搖床上，染色2h。脫色：染色后的凝膠浸泡于考馬斯亮藍脫色液脫色，至膠成透明觀察結果并拍照保存。

1.2.3 蛋白純化 鎳柱親和層析方法純化。菌液于5000rpm離心5min，用PBS重懸，重復離心2次；超聲破碎，4℃離心，收集包涵體。BufferB溶解，4℃12000rpm離心30min，上清用0.45um濾器過濾，用鎳柱純化，SDS-PAGE觀察純化情況。BCA法測蛋白濃度.

1.2.4 多克隆抗體制備 5只健康青年兔，預飼養1周，用不完全佛式佐劑乳化表達蛋白1mg/kg，皮下注射；間隔2周，用完全佛式佐劑乳化表達蛋白1mg/kg連續皮下注射2次；第3次免疫后3周間接ELISA法測抗體效價，效價達到1:106后頸靜脈采血全部血清，-20℃保存。

1.2.5 血清抗體純化 首先用辛酸硫酸銨法進行初次純化，然后使用親和純化介質進行二次純化。（1）三份60mmol/L pH4.5醋酸鈉緩沖液，與一份血清攪拌混勻，在室溫環境下邊攪拌邊緩慢滴加25μl/ml辛酸(血清稀釋液)，攪拌30min，以12000×g離心30min，棄去底部沉淀物，用紗布過濾上清液去除雜質，根據1/10上清液體積加入10×PBS，將pH調至7.2~7.6之間，將其放入低溫冰箱預冷至4℃，在冰浴環境中邊攪拌邊加入硫酸銨至溶液中，待其達到飽和點后，繼續攪拌20min，用12000×g離心30min，棄去上清，將沉淀溶解在PBS中，透析過夜。（2）將親和層析介質充分混勻，緩慢加入到層析柱中(切勿產生氣泡)，靜置20min，其中的層析介質會自然下沉，加入平衡液平衡層析介質，緩慢的流速(1ml/min)流出平衡液。將上述純化并透析的抗體與平衡液按照1:1稀釋混勻，加入到層析柱中，流速約為1ml/min，為了提升介質與抗體的結合，可以重復加樣2~3次，通過25ml的平衡溶液洗滌介質除去非目的蛋白，平衡液的流速約2ml/min。用10ml洗脫液洗脫目的蛋白，流速保持在0.5ml/min左右，并分管收集洗脫液，為了防止pH過低對抗體影響，應馬上加入1/10洗脫液體積的中和液，將洗脫液的pH調至7.2~7.6。用0.1 mol/L PBS透析純化后的抗體透析36h，每隔6h進行換液。

1.2.6 抗體亞群鑒定 采用抗體亞類鑒定試劑盒對多克隆抗體進行鑒定。具體操作過程如下：（1）PBS緩沖液稀釋純化的gp85蛋白，至抗體濃度5-10μg/ml，將稀釋好抗體按100μl/孔加入96孔ELISA板內，4℃過夜；（2）棄上清，PBS’T(含0.05%吐溫20的0.01mol/L PBS緩沖液)洗板5次，甩干板內殘余液體，每孔加入200μL的封閉液(5%脫脂奶粉的PBS’T緩沖液)，室溫孵育1h；（3）棄上清，同樣方法洗板后甩干后，加入100μL/孔的雜交瘤細胞上清(同一種細胞上清樣品加6個孔)，室溫孵育1h；（4）按照同樣方法洗板甩干后，加入稀釋3000倍的兔抗鼠抗體亞類二抗(主要有羊抗鼠IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgA、IgM)加入上述6個孔內，室溫孵育1h；（5）洗板甩干后，每孔加入1:3000倍稀釋的HRP-羊抗兔IgG，100μl每孔，37℃孵育1h，同樣方法洗板；（6）加底物：每孔加入TMB單組份底物顯色液，100μl每孔，37℃孵育15min；（7）終止顯色：每孔加入50μl 2M H2SO4終止液終止顯色，輕輕震蕩混勻，測OD450值。

1.2.7 多克隆抗體的識別檢測 按常規方法制備CEF(雞胚成纖維細胞)，均勻培養于24孔細胞板內。待細胞長至70%~80%滿時，接種ALV-K-JS11C1病毒及無病毒的DMEM基礎培養基，每份樣品做兩個重復；將培養板置于細胞培養箱中孵育2h后棄掉上清，更換0.5%DMEM維持液。維持5d后取出培養板用于IFA試驗。用腹水和雜交瘤細胞培養液上清的稀釋液作為一抗，1:100倍稀釋的FITC標記的羊抗鼠作為二抗，免疫小鼠的陽性血清作為陽性對照，DMEM基礎培養基作為空白對照。具體步驟見2.3.5.2。通過熒光顯微鏡觀察細胞質呈現綠色熒光者判定為陽性細胞。

2 結果

2.1 gp85蛋白的誘導表達

將重組表達質粒pET32a-SDAU09C1-gp85轉化至受體菌BL21內，IPTG誘導表達后收集包涵體蛋白，純化重組gp85蛋白，SDS-PAGE檢測分析(見圖1)：含表達載體的BL21菌體裂解物和純化后蛋白于55KD處顯示出清晰條帶，陰性對照(未用IPTG誘導含表達載體的BL21，收集該菌體裂解物)未顯示出55KD的條帶。結果表明：含重組表達質粒的BL21菌體在IPTG誘導下能有效表達gp85蛋白，經純化后可獲得純度較高的his-gp85融合蛋白。

圖1 重組蛋白表達分析

M, 蛋白相對分子質量; 1, 未用IPTG誘導的菌體裂解物; 2, 0.5μg/ml IPTG誘導的菌體裂解物; 3, 1.0μg/ml IPTG誘導的菌體裂解物

圖2 重組蛋白Western

-blot鑒定M, 蛋白相對分子質量; 1, 一抗為his標簽 MAb的Western-blot分析

2.2 表達產物Western blotting鑒定

以抗his標簽蛋白的抗體為一抗，HRP標記的羊抗鼠IgG為二抗，對純化后的his-gp85融合蛋白進行western blot分析。圖2結果表明在55KD的位置上可見一條清晰的免疫反應帶，說明大腸桿菌有效的表達了his-gp85蛋白?

2.3 多克隆抗體的效價檢測

以純化的融合蛋白為包被抗原，采集四免后14d的兔血清為一抗，間接ELISA法測定多克隆抗體效價(見表1)。表明抗體效價為8×105~5.12×107。

表1 四免后兔血清ALV-K抗體效價

2.4 多克隆抗體的純化及純化的效價檢測

經免疫后的兔血清含有許多血清蛋白，經抗體純化試劑盒純化后，獲得純度較高、含量較多的血清免疫球蛋白抗體(見圖3)。間接ELISA法測定純化后的抗體效價為8.1×105。

圖3 ALV-K多克隆抗體純化檢測

M: 蛋白質相對分子質量; 1: 多克隆抗體純化前; 2: 多克隆抗體純化后

圖4 多克隆抗體Western-blot鑒定

M, 蛋白相對分子質量; 1和2, ALV-Kgp85蛋白與多克隆抗體的Western-blot

2.5 多克隆抗體的亞型檢測

經抗體亞類檢測試劑盒所測定的結果顯示，多克隆抗體類型為IgG2b。

2.6 多克隆抗體的識別檢測

（1）用純化后的兔源pAb作為一抗，HRP標記的羊抗兔IgG用作二抗，使用ALV-K gp85重組蛋白進行Western-blot分析(見圖4)。可以看出，在55KD處一條清晰的免疫條帶，表明純化后的抗體可與ALV-K gp85蛋白特異性的結合。（2）通過用ALV-K-JS11C1病毒在細胞板上接種DF-1細胞，通過IFA法驗證抗體的特異性。把純化后抗體用作為一抗，FITC標記的羊抗兔IgG用作二抗，使用倒置熒光顯微鏡拍攝(見圖5)。結果表明，圖A中DF1細胞細胞質呈現綠色熒光，圖B空白對照孔卻無特異性綠色熒光信號，說明純化后抗體都能與ALV-K-JS11C1病毒反應。

圖5 多克隆抗體IFA分析

A, 多克隆抗體對DF1細胞中ALV-K的識別; B, 隱性對照

3 討論

（1）ALV-K是外源性ALV一種亞型，主要發現于我國地方雞群中[2]。中國地方種禽資源豐富，地方品系雞幾乎都保持著自繁自養的模式,但近幾年中國地方優良種雞的飼養向規模化、集約化發展，腫瘤性疾病也日益凸顯[3]。地方品系雞除存在ALV-K的感染外，也從部分地方品系雞中分離到其它亞群如ALV-J、ALV-A和ALV-B等[7-9]，這表明中國雞群中ALV感染的復雜性。（2）本研究將實驗室構建的含ALV-K gp85基因的重組表達質粒轉化至大腸桿菌BL21宿主菌獲得了能穩定表達gp85-his融合蛋白的菌液。免疫青年大白兔制備出ALV-K抗免血清，對血清進行純化，獲得含IgG較高的抗血清，經Western-blotting和IFA分析表明，該血清抗體能很好地與ALV-K gp85蛋白和病毒結合，為ALV-K鑒定檢測提供很好的物質基礎。（3）利用在大腸桿菌中表達的重組蛋白可以制備大量抗血清，可以用于臨床上的Ｋ亞群禽白血病快速診斷[10]。與以往的PCR和克隆測序診斷方法相比，利用該抗血清通過IFA檢測更方便、更準確；與國外IDEXX公司生產抗體檢測試劑盒只能檢測血清抗體相比，該抗血清能特異性地檢測ALV-K的感染，彌補了外源性ALV單克隆抗體的不足，也能彌補抗體檢測試劑盒不能檢測ALV-K的不足。

4 結論

本研究獲得能夠識別ALV-K gp85蛋白的兔源多克隆血清抗體，經純化后可以用于ALV-K的IFA鑒別檢測。

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（2019–10–08）

國家林業局中央本級專項（2130211）；國家重點研發專項（2016YFD0500803）；國家大學生創新性實驗計劃立項項目（201810434022）；山東省“雙一流”獎補資金

?共同第一作者

S852.4+3

A

1007-1733(2019)12-0001-04