酶及細胞固定化技術

鄭雪凌 崔向珍

【摘要】酶作為生物體內的催化劑，具有高效性和高特異性的特點。但在工業生產中，酶穩定性差、易流失，造成成本過高，限制其廣泛應用。因此將酶采用固定化技術，使酶在發揮其高效、專一性同時，還能增強酶的貯存穩定性，提高了生產效率，節約了成本。本文對酶和細胞的固定化技術進行綜述。

【關鍵詞】酶 細胞 固定化 載體 應用

酶及細胞固定化技術是生物技術的重要組成部分。20世紀60年代出現了固定化酶技術，60年代末固定化酶技術用于工業生產，70年代出現了固定化細胞技術，80年代又發展了固定化增殖細胞技術以及包括輔助因子在內的固定化多酶反應體系技術。工程技術日益成熟，成為近代工業生產中不可缺少的組成部分。

所謂固定化技術，是指利用化學或物理手段將游離的酶或細胞（微生物），定位于限定的空間區域并使其保持活性和可反復使用的一種基本技術，包括固定化酶技術和固定化細胞技術。固定化細胞的制備方法是多種多樣的，任何一種限制細胞自由流動的技術，都可以用于制備固定化細胞。一般來說，固定化技術大致可以分成吸附法、共價結合法、交聯法和包埋法等4大類，其中以包埋法使用最為普遍。

一、固定化技術分類

1.吸附法

很多細胞都有吸附到固體物質表面的能力，這種吸附能力可以是天生具有的，也可以是經過處理誘導產生的，依靠這種吸附能力，人們發展起許多廉價而又有效的固定化方法。吸附法可分為物理吸附法和離子吸附法，前者是使用具有高度吸附能力的硅膠、活性炭、多孔玻璃、石英砂和纖維素等吸附劑將細胞吸附到表面上使之固定化，是一種最古老的方法，操作簡單、反應條件溫和、載體可以反復利用，但結合不牢固，細胞易脫落。后者根據細胞在解離狀態下可因靜電引力（即離子鍵合作用）而固著于帶有相異電荷的離子交換劑上，如DEAE-纖維素、DEAE-Sephadex、CM-纖維素等。

2.共價結合法

共價結合法是細胞表面上功能團和固相支持物表面的反應基團之間形成化學共價鍵連接，從而成為固定化細胞。該法細胞與載體之間的連接鍵很牢固，使用過程中不會發生脫落，穩定性好，但反應條件激烈、操作復雜、控制條件苛刻。有人用此法將卡爾酵母固定在已活化的多孔玻璃珠上，雖然細胞已經死亡，但仍然保留生產尿酐酸的活性。利用此法制備的固定化細胞，細胞大多死亡。

3.交聯法

交聯法與共價結合法一樣，都是靠化學結合的方法使細胞固定化。如采用戊二醛或偶聯苯胺等帶有兩個以上的多功能團交聯劑與細胞進行交聯，可形成固定化細胞，但反應條件激烈，對細胞活性影響大。千煙一郎曾用此法制得具有天冬氨酸酶活力的固定化大腸桿菌細胞，也有人用此法制得具有葡萄糖異構酶活力的固定化細胞。

4.包埋法

包埋法是細胞固定化最常用的方法。按照包埋材料的結構可分為凝膠包埋和微膠囊包埋，即將細胞包裹于凝膠的微小格子內或半透膜聚合物的超濾膜內。該方法操作簡單，對細胞活性影響較小，制作的固定化細胞顆粒的強度較高，目前被廣泛地用于廢水處理。

四種固定化方法各有所長，其中包埋法是相對較好的一種方法，幾種方法聯用，往往效果更好。無論采用何種方法，固定化酶的穩定性是首要考慮的因素。酶、載體及試劑的費用、操作難易等與工業化有關的因素也必須考慮。科研人員在研究時，應盡量選用價格低廉、易得的載體和試劑，載體最好是已在其他工業生產中大量使用的材料，同時也要考慮其應用時的安全性。

二、固定化細胞（酶）載體的特性

一種較為理想的固定化載體應滿足5個要求：①固定化酶或細胞的活性回收率要高;②材料容易獲得;③價格便宜;④操作制備方便，能適用于大規模生產;⑤有較高的機械強度，能較長時間使用和重復使用。目前所采用的固定化細胞（酶）載體主要有瓊脂、明膠、海藻酸鈉、硅藻土、聚乙烯醇，這5種載體的特性和差別主要有以下幾個方面：

（1）在5種載體中，瓊脂機械強度極差，實用性低。

（2）明膠強度較低，內部結構緊密，傳質性能較差。

（3）海藻酸鈉凝膠和聚乙烯醇凝膠機械強度較好。電鏡觀察表明內部呈多孔結構，對生物的毒性小，固定操作容易。兩者比較，聚乙烯醇凝膠的機械強度優于海藻酸鈉凝膠，但海藻酸鈉凝膠的傳質性能比聚乙烯醇凝膠好。

三、固定化技術的生物反應器

最簡單的生物反應器為分批式反應器，制作這種反應器只需要加入游離酶或固定化酶（細胞），使之懸浮于攪拌罐中，而不需要支持性裝置。反應結束后只需離心或過濾，便可從中分離出酶。這種反應器適合各種反應，設備成本低，但固定化酶（細胞）在回收過程中易損失，因此工業規模應用較少，對小規模試驗合適。

另一種生物反應器是連續流反應器，即將粉狀、塊狀固定化酶（細胞）制成酶（細胞）柱，通入底物溶液，產物便可連續流出。連續流反應器比分批式反應器工作固定，減少操作費用，易于自動控制和掌握產品的質量。

最新研制出了一種新型膜反應器。這種反應器應用一定的半透膜或超過濾膜，游離酶在膜的一側或固定在膜上，酶反應可連續進行，反應產物通過半透膜濾去，消除了產物對酶反應的抑制，使酶反應不斷沿著生成產物的方向進行，并且不需乳化便可進行兩相反應。

四、展望

目前，固定化技術已在食品工業、精細化學品工業、醫藥等行業得到廣泛應用，在廢水處理方面也取得了一定進展。用固定化技術生產化工產品，條件溫和，無三廢產生，隨著人類對環保的日益關注，固定化應用會更受關注，如何充分利用天然高分子載體，對其改性，或利用納米技術、膜技術等來進行固定，必定會成為研究的熱點。同時，開發新型、高效固定化反應器，進一步提高轉化率和生產能力，也是未來研究的重點。而固定化酶（細胞）在各行業的應用研究也必將推動酶固定化技術的進一步發展。

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