殺菌劑對幾種果蔬采后病害生物測定試驗方法的綜述

摘 要：

殺菌劑的生物測定實驗主要包括病原菌的采集、分離與提純、離體培養及殺菌劑室內毒力測定。生長速率法、抑菌圈法、孢子萌發法等均是常用的殺菌劑室內毒力測定方法。本文概述了我國部分重要的果蔬采后病害的生物測定方法，并對未來果蔬采后病害的綜合防治方法做出展望。

關鍵詞：

果蔬;殺菌劑;采后病害;室內毒力測定

中圖分類號：S482.2

文獻標識碼：A

DOI：10.19754/j.nyyjs.20191130015

1 果樹及蔬菜病原菌的采集、分離與純化以及離體培養

1.1 病原物的采集

在筆者所查閱的文獻中，研究人員采集果樹及蔬菜病原菌的方法可大致分為從田間病樣中采集培養和直接使用高校或科研院所保藏的菌株2類。從田間收集病樣后，組織分離法是較為常見的采集方法。以西北地區常見的蘋果腐爛病病菌（Cytospora spp.）為例，臧睿[1]等從陜西省不同的蘋果產區，收集有蘋果腐爛病的病枝，按常規組織塊分離法采集病原菌，將各分離病原菌株接種離體枝條再從病部挑取繁殖體在PDA培養基上來純培養病原菌。惠娜娜[2]等在研究蘋果腐爛病菌時，從當地蘋果園的病樣上用組織分離法來采集病原菌，并進一步挑取菌落邊緣的菌絲來進行分離純化。該文獻中對組織分離法有著詳細的描述，組織分離法大致可分為從病健交界處切下小塊，3%次氯酸鈉溶液中消毒，70%酒精消毒，無菌水清洗，無菌濾紙自然晾干，PDA培養基培養5步。對于一些常用的菌株，一些科研機構一般會有所保藏，這樣，科研工作者在研究時可以直接活化菌株后使用，省時省力，而且所用病原菌的純度較高，可以節省后續分離純化的步驟。王帥等在研究蘋果腐爛病菌時，直接利用西北農林科技大學提供的蘋果腐爛病菌菌株進行研究。

1.2 病原物的分離純化

在筆者所查閱的文獻中，平板劃線法和稀釋涂布法是較為常用的分離純化方法，這2種方法中，又以平板劃線法使用較多。以新疆地區的厚皮甜瓜采后病害為例，陳存坤等、毛曉英等、吳倩等在各自的研究中，均采用組織分離法采集病原菌，并進一步用平板劃線法或稀釋涂布法分離純化。

1.3 病原物的離體培養

對于病原菌的離體培養，要根據所研究病原菌的生物學特性選用合適的培養基，常用的培養基有PDA培養基、PSA培養基等。

2 殺菌劑室內毒力測定方法的研究

殺菌劑室內毒力測定方法主要有生長速率法、抑菌圈法、孢子萌發法。在筆者所查閱的文獻中，生長速率法、孢子萌發法是最為常用的殺菌劑室內毒力測定方法。其中，生長速率法與抑菌圈法側重于研究殺菌劑對病原菌菌絲體生長的抑制作用，孢子萌發法側重于研究殺菌劑對病原菌孢子萌發的抑制作用。生長速率法較抑菌圈法操作步驟少，故應用較多。

2.1 生長速率法

在筆者所查閱的文獻當中，應用生長速率法的有5篇，涉及草莓灰霉病、洋蔥黑霉及基腐病、西瓜枯萎病和番茄的某類采后病害。生長速率法的一般操作為用一定孔徑的打孔器從活化的病原菌菌落邊緣上打取菌塊，分別接種到含或不含殺菌劑的平板中，培養一段時間后用十字交叉法垂直測量菌落直徑并比較，計算生長抑制率。

草莓是我國重要的經濟性水果，草莓灰霉病是草莓生產上重要的采后病害，其病原物為灰葡萄孢（Botrytis cinerea），楊敬輝等采用菌絲生長速率法測定了50%啶酰菌胺對草莓灰霉病菌的毒力，待對照中菌落快長滿平皿時，采用十字交叉法量取菌落直徑，并計算菌絲生長平均抑制率。Joon-Oh Kim等人測定了咯菌腈、異菌脲、嘧霉胺、戊唑醇、苯吡唑胺、啶酰菌胺對灰葡萄孢的防治效果。在生長速率測定法中通過測量菌絲體在添加了殺菌劑與未添加殺菌劑的培養基中菌絲體的線性生長量，通過將添加了殺菌劑的PDA線性生長速率與未添加殺菌劑的PDA線性生長速率進行比較來確定生長抑制率。

洋蔥的黑霉病由Aspergillus niger引起，基腐病由Fusarium oxysporum f.sp. cepae引起，這2種病害是在洋蔥的儲藏期造成巨大損失的病害，A.S. Futane等人利用生長速率測定法測定了10種殺菌劑對2種病原物菌絲體生長的抑制作用，并計算菌絲體生長的抑制百分比，進而找到對洋蔥黑霉病、基腐病防治效果較好的殺菌劑。

Mark等人利用生長速率法測定二氧化氯氣體熏蒸對Alternaria alternate、Stemphylium vesicarium的防治效果。Mark等所使用的是氣體熏蒸作用的殺菌劑ClO2，首先氣體熏蒸處理一段時間，后續操作同上。

許彥等采用生長速率法測定幾種殺菌劑對西瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum f.sp. niveum）的室內毒力，所采用的生長速率法與上述相似。

2.2 抑菌圈法

在筆者所查閱的文獻當中，應用抑菌圈法的較少，只有1篇。細交鏈孢菌（Alternaria alternata ）可引起梨黑斑病、草莓黑斑病等多種病害。崔娜等選取市面上常見的18種殺菌劑采用抑菌圈法對細交鏈孢菌進行室內抑菌效果測定。配制好分生孢子懸浮液，在培養皿中倒入純瓊脂培養基，冷凝后插入牛津杯。將配置好的分生孢子懸浮液與PDA培養基按一定的比例混合，取部分培養基倒入純瓊脂培養基上方制成平板，待培養基冷凝后拔出牛津杯，形成一個小圓孔，然后在小圓孔內加入殺菌劑，用十字交叉法測量抑菌圈邊緣至小圓孔邊緣的距離 （抑菌距離），用以評價供試菌對不同藥劑的敏感性。

2.3 孢子萌發法

在筆者所查閱的文獻當中，應用孢子萌發法的有5篇。在所查閱的文獻中，孢子萌發法的基本操作相同，但在某些操作中又有區別，有的采用玻片法，有的采用懸滴法。

王帥等在研究生物源殺菌劑對蘋果樹腐爛病菌的室內活性評價時，測定了10種生物源殺菌劑對Valsa mali分生孢子萌發的抑制效果。操作可分為分生孢子懸浮液配制和玻片法2步。將殺菌劑與PDA培養基混勻，制成含藥培養基，切取1cm2左右的含藥培養基放置于載玻片上，滴入配制好的分生孢子懸浮液，涂抹均勻，培養一段時間后在普通光學顯微鏡下統計分生孢子的萌發情況并計算萌發抑制率。

Joon-Oh Kim等人采用室內毒力測定方法較為全面，包含生長速率法、孢子萌發法和殺菌劑對產孢抑制的作用3個方面。生長速率法在前面已講，此處不再贅述。采用孢子萌發法做室內毒力測定，實驗步驟與王帥等的相同，通過比較菌株在對照培養基和添加有殺菌劑的培養基上的分生孢子產生數量來測算產孢抑制率。

黃海等在進行番茄灰霉病菌室內毒力測定及藥效試驗時采用了孢子萌發法測定40%多菌靈（WP）、50%異菌脲（WP）和40%嘧霉胺（WP）對番茄灰霉病菌孢子萌發的抑制作用。其使用的方法與王帥等的略有不同，其使用無菌水來溶解藥液，并使孢子懸浮液與不同濃度的藥液混合，在吸取部分混合液滴到凹玻片上，測算孢子萌發抑制率。

趙新海等在研究康地蕾得對黃瓜枯萎病的室內生物活性測定時，采用孢子萌發法進行了康地蕾得對黃瓜枯萎病菌的室內毒力測定。實驗主要包括孢子懸浮液配制與懸滴法測定孢子萌發率2步，但文獻中并未對懸滴法做出比較詳細的解釋。

蘋果黑星病的病原物為Venturia inaequalis，Umit Arslan研究硼酸、磷酸二氫鉀、焦亞硫酸鈉控制蘋果黑星病的效用，采用孢子萌發法測試以上物質及戊唑醇與氟吡菌酰胺的混合藥液的殺菌毒力，將孢子懸浮液加入到有土豆葡萄糖培養基（PDB）組織培養平板孔中，在培養基中分別添加上述殺菌物質，之后取試樣在顯微鏡下培養觀察，并統計孢子的萌發率。

3 展望

由于采后農產品的生理和生化變化，在收獲后和儲存期間新鮮農產品對采后疾病的敏感性增加，這有利于采后病原物的生長發展和采后疾病的發生，也是通過供應鏈造成損失的主要原因。目前，化學殺菌劑仍然是防治果蔬采后病害的有效手段。但是，病原物的抗藥性和殺菌劑的殘留問題正在促使研究者不斷探索其他防治方法。本研究能為果蔬采后病害化學殺菌劑的合理使用打下牢固的基礎，對果蔬采后病害的綜合治理也具有借鑒意義。在未來的采后病害防治中，化學防治、生物防治、物理防治技術的探索以及綜合使用將會不斷發展。

參考文獻

[1]臧睿，黃麗麗，康振生，王旭麗.陜西蘋果樹腐爛病菌（Cytospora spp.）不同分離株的生物學特性與致病性研究[J].植物病理學報，2007（04）：343-351.

[2]惠娜娜，郭建明，李繼平，張大為，王立，鄭果.6種殺菌劑對蘋果樹腐爛病菌的毒力測定及田間防治效果[J].中國果樹，2018（06）：54-56.

作者簡介：

張俊有（1968-），男，農藝師。研究方向：果樹栽培、病蟲防治、農產品質量安全。