異氟醚吸入麻醉對(duì)大鼠認(rèn)知功能及海馬組織中BDNF、MMP-9、炎癥因子表達(dá)的影響

孫虎，陳曉芳，王濤，薛瑞，徐志新

(1 海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院，海口570311；2 中國(guó)人民解放軍軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院)

術(shù)后認(rèn)知功能減退是手術(shù)常見(jiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥[1]，麻醉藥是其常見(jiàn)的原因之一[2]。神經(jīng)認(rèn)知功能主要與中樞海馬神經(jīng)細(xì)胞的功能有關(guān)[3～5]，而海馬神經(jīng)細(xì)胞功能的強(qiáng)弱取決于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞或神經(jīng)細(xì)胞合成的腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)的水平[6，7]。血腦屏障是保護(hù)腦組織的關(guān)鍵，而內(nèi)源性水解酶基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)與屏障的通透性密切相關(guān)。在應(yīng)激條件下，中樞神經(jīng)系統(tǒng)能釋放TNF-α、IL-6及IL-1β等炎性因子，過(guò)度合成能誘導(dǎo)局部炎性細(xì)胞的聚集及其他相關(guān)細(xì)胞因子的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從導(dǎo)致中樞神經(jīng)細(xì)胞損傷，引起記憶及情感功能障礙[8，9]。異氟醚(ISO)是臨床上常用的吸入麻醉藥[10]，有研究認(rèn)為其可引起神經(jīng)認(rèn)知功能減退[11]，但機(jī)制尚不明確。2018年1～10月，我們觀察了ISO吸入麻醉后大鼠認(rèn)知功能及海馬組織中BDNF、MMP-9、炎癥因子表達(dá)的變化，探討ISO對(duì)認(rèn)知功能的影響及可能的機(jī)制。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑、儀器 選取54只10周齡的健康雄性SD大鼠，體質(zhì)量220～250 g，清潔級(jí)，購(gòu)自斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司(許可證號(hào)：SCXK2016-0002)；大鼠正常進(jìn)食、進(jìn)水，常規(guī)喂養(yǎng)于光照間隔12 h、室溫23～25 ℃、相對(duì)濕度45%～60%的環(huán)境中。ISO(山東魯南制藥集團(tuán))；XR-XM101水迷宮系統(tǒng)(上海欣軟科技信息公司)； LC500型動(dòng)物麻醉箱(上海玉研科學(xué)儀器有限公司)；麻醉機(jī)(上海普辛儀器科技有限公司)；TNF-α、IL-6、IL-1β檢測(cè)試劑盒(南京建成生物科技研究所)，ABI 2720 PCR檢測(cè)儀(美國(guó)賽默飛公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組與干預(yù)處理 動(dòng)物適應(yīng)飼養(yǎng)環(huán)境后以隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組、對(duì)照組及ISO組，每組18只，分籠飼養(yǎng)；每日大鼠放入麻醉箱15 min適應(yīng)麻醉環(huán)境，7 d后進(jìn)行干預(yù)處理。ISO組給予ISO吸入麻醉：呼吸機(jī)螺紋管連接麻醉箱，調(diào)節(jié)氣閥壓力，麻醉機(jī)輸出3%的ISO，觀察大鼠反應(yīng)；翻正反射消失后，調(diào)節(jié)ISO輸入濃度至1.8%維持麻醉，維持麻醉時(shí)間60 min；吸入麻醉過(guò)程中，大鼠吸入40%氧氣和空氣混合氣體。對(duì)照組麻醉箱內(nèi)吸入40%氧氣和空氣混合氣體60 min，空白組麻醉箱內(nèi)自由吸入空氣60 min。

1.2.2 大鼠認(rèn)知功能觀察 采用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)。干預(yù)前3 d開(kāi)始行定位航行訓(xùn)練，每天1次，大鼠自入水至站上站臺(tái)時(shí)間為逃避潛伏期。干預(yù)前1 d行空間探索訓(xùn)練，記錄大鼠60 min內(nèi)穿越站臺(tái)所在位置的次數(shù)，評(píng)估其空間記憶能力。分別干預(yù)后第1、4、7天每組取6只行迷宮訓(xùn)練，記錄逃避潛伏期、穿越平臺(tái)次數(shù)，分別評(píng)估其學(xué)習(xí)、空間記憶能力。

1.2.3 海馬組織標(biāo)本采集 分別于水迷宮試驗(yàn)后，腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉，低溫下斷頭后取腦組織；切取海馬并稱重，深低溫保存。

1.2.4 大鼠海馬組織TNF-α、IL-6、IL-1β檢測(cè) 采用比色法。將海馬組織解融后沖洗剪碎，稱取50 mg放入小燒杯中，加入9倍重量勻漿液(0.9% NaCl， Tris-HCl 0.1 mmol/L，pH 7.4，蔗糖0.01 mmol/L，EDTA-Na20.01 mol/L，)；移入勻漿器，反復(fù)研磨；加入9倍重量勻漿液，低溫離心后吸取上清液。 檢測(cè)板設(shè)置空白對(duì)照、標(biāo)準(zhǔn)品及樣品孔，室溫平衡后各孔依次加入標(biāo)準(zhǔn)品，樣品孔加入組織勻漿上清液；依次加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗體，溫育；洗滌沖板后加入底物，充分反應(yīng)后加入終止液終止反應(yīng)；檢測(cè)各孔450 nm處的吸光度，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算檢測(cè)勻漿組織中相應(yīng)的炎性細(xì)胞因子濃度。

1.2.5 大鼠海馬組織中BDNF、MMP-9 mRNA檢測(cè) 采用RT-PCR法。TRIzol法提取總RNA，以DEPC處理水溶解；加入2.5倍體積75%乙醇，無(wú)RNase的水定容至過(guò)飽和；加入Buffer OBB 和Oligotex Suspension，水浴、退火、重懸，離心提取mRNA，沉淀備用。進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，在GenBank查找目的基因序列，用Primer express 2.0 軟件在CDS區(qū)設(shè)計(jì)特異性引物，用ABI 3900臺(tái)式高通量DNA合成儀合成引物。引物序列: BDNF上游5′-CTGTATCAAAAGGCCAACTGAA-3′，下游5′-GTGTCTATCCTTATGAATCGCCA-3′；MMP-9上游5′-GGCACATAGTAGGCCCTTTAA-3′，下游5′-TCACTCCTTTCTTCCTAGCCA-3′，內(nèi)參GAPDH上游5′-GAAGGTGAAGGTcGGAGTC-3′，下游5′- GAAGATGGTGATGGGATGG-3′。PCR擴(kuò)增的陽(yáng)性產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳，顯示條帶后割下條帶、回收、純化為陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品，純度為OD260/OD280>1.8；待測(cè)樣本和陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品PCR反應(yīng)， 產(chǎn)物凝膠電泳分析(40 V電泳6 h)；以GAPDH的拷貝數(shù)作為校正基數(shù)，計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。目的基因相對(duì)表達(dá)量=目的基因Ct值/內(nèi)參照 Ct值。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠認(rèn)知功能比較 干預(yù)第1天，ISO組逃避潛伏期長(zhǎng)于對(duì)照組和空白組，穿越平臺(tái)次數(shù)少于對(duì)照組和空白組(P均<0.05)；干預(yù)第4、7天，三組大鼠逃避潛伏期及穿越次數(shù)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠逃避潛伏期及穿越次數(shù)比較

注：與對(duì)照組同時(shí)點(diǎn)比較，aP<0.05；與空白組同時(shí)點(diǎn)比較，bP<0.05。

2.2 各組大鼠海馬組織中TNF-α、IL-6、IL-1β表達(dá)比較 干預(yù)第1天，ISO組大鼠海馬組織中TNF-α、IL-6、IL-1β表達(dá)水平高于對(duì)照組和空白組(P均<0.05)；干預(yù)第4、7天，三組各指標(biāo)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠海馬組織中TNF-α、IL-6、IL-1β表達(dá)比較

注：與對(duì)照組同時(shí)點(diǎn)比較，aP<0.05；與空白組同時(shí)點(diǎn)比較，bP<0.05。

2.3 各組大鼠海馬組織中BDNF、MMP-9 mRNA表達(dá)比較 干預(yù)第1天，ISO組大鼠海馬組織中BDNF mRNA表達(dá)水平低于對(duì)照組和空白組，且MMP-9 mRNA表達(dá)水平高于對(duì)照組和空白組(P均<0.05)；而干預(yù)第4、7天，三組各指標(biāo)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表3。

3 討論

ISO在全麻誘導(dǎo)和麻醉維持中應(yīng)用較多，能夠?qū)χ袠猩窠?jīng)系統(tǒng)進(jìn)行下行性抑制，能夠抑制神經(jīng)肌接頭的沖動(dòng)傳導(dǎo)發(fā)揮肌松作用。ISO在發(fā)揮中樞抑制的同時(shí)，也能引起中樞功能的異常，如腦電異常甚至癲癇、記憶功能障礙等，但其深入的機(jī)制目前尚不完全明確。海馬是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中與記憶、學(xué)習(xí)密切相關(guān)的部位，其生理活動(dòng)與多個(gè)神經(jīng)傳導(dǎo)通路有關(guān)，有多種神經(jīng)遞質(zhì)及細(xì)胞因子的參與，過(guò)程極為復(fù)雜；而麻醉藥物對(duì)記憶及學(xué)習(xí)功能的影響，也是通過(guò)多種機(jī)制作用的結(jié)果。

學(xué)習(xí)記憶能力檢查通常采用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)，包括空間位置感知和方向感知兩方面來(lái)反映學(xué)習(xí)記憶功能[11]。本研究結(jié)果顯示，ISO組吸入ISO麻醉后第1天，水迷宮實(shí)驗(yàn)潛伏期增長(zhǎng)、穿越平臺(tái)次數(shù)減少，說(shuō)明吸入ISO能夠引起認(rèn)知功能的障礙；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在干預(yù)后第4、7天，各組大鼠的水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果無(wú)顯著差異，說(shuō)明ISO引起的認(rèn)知功能障礙的作用時(shí)間較短，且可完全恢復(fù)正常認(rèn)知功能。

表3 各組大鼠海馬組織中BDNF、MMP-9 mRNA表達(dá)比較

注：與對(duì)照組同時(shí)點(diǎn)比較，aP<0.05；與空白組同時(shí)點(diǎn)比較，bP<0.05。

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，腦部炎癥反應(yīng)是認(rèn)知功能減退的主要影響因素，其中IL-6、TNF-α、IL-1β被認(rèn)為典型的促炎因子[12]，上述炎性因子相互調(diào)節(jié)共同影響中樞多種功能。正常生理狀態(tài)下，細(xì)胞因子參與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、腦細(xì)胞損傷修復(fù)和自身免疫過(guò)程；但病理狀態(tài)下，細(xì)胞因子通過(guò)自分泌或與其他細(xì)胞因子間的相互作用產(chǎn)生大量細(xì)胞因子，一旦炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)被啟動(dòng)，神經(jīng)系統(tǒng)就會(huì)受到影響，甚至導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙。本研究發(fā)現(xiàn)，ISO組吸入ISO后第1天海馬組織中IL-6、IL-1β、TNF-α水平上升，對(duì)照組及空白組各指標(biāo)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這說(shuō)明IL-6、IL-1β、TNF-α升高與吸入ISO有關(guān)，可能與ISO的直接作用及其引起的腦部血流動(dòng)力學(xué)改變有關(guān)。在干預(yù)后第4、7天，ISO組海馬組織中IL-6、IL-1β、TNF-α水平恢復(fù)正常，同時(shí)大鼠的認(rèn)知功能也恢復(fù)正常，提示IL-6、IL-1β、TNF-α等炎癥因子可能參與了吸入ISO后認(rèn)知功能障礙的發(fā)生過(guò)程。

神經(jīng)元突觸的完整性和信息傳遞的連貫性是保證正常認(rèn)知功能的關(guān)鍵。BDNF是突觸形成、改建和信息傳遞過(guò)程中重要的調(diào)節(jié)因子，可保證突觸的可塑性，在促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞再生、分化、信號(hào)傳遞、突觸可塑性等方面起著重要作用。本研究顯示，ISO組在吸入ISO第1天海馬組織中BDNF mRNA表達(dá)水平降低，提示其參與了認(rèn)知功能障礙的發(fā)生過(guò)程[13,14]；在干預(yù)后第4、7天，BDNF mRNA均恢復(fù)至正常水平，同時(shí)大鼠的認(rèn)知功能也恢復(fù)正常，提示BDNF mRNA表達(dá)上調(diào)可促進(jìn)ISO所致認(rèn)知障礙損傷的恢復(fù)。MMP-9可分解明膠、Ⅳ膠原和彈性蛋白等蛋白質(zhì)類物質(zhì)，參與細(xì)胞外基質(zhì)降解和膠原合成過(guò)程；另外，其也屬于炎性因子的一種，在炎癥和惡性腫瘤的形成過(guò)程中起重要作用[15]。本研究結(jié)果顯示，ISO組干預(yù)后第1天海馬組織中MMP-9 mRNA表達(dá)水平上升。這說(shuō)明ISO可上調(diào)MMP-9 mRNA的轉(zhuǎn)錄、合成水平，促進(jìn)MMP-9的高表達(dá)；高水平狀態(tài)的MMP-9通過(guò)降解細(xì)胞外基質(zhì)，破壞毛細(xì)血管間緊密連接和基底膜，破壞血腦屏障，引起腦水腫，進(jìn)一步加重神經(jīng)認(rèn)知功能障礙[16]。

綜上所述，ISO吸入麻醉會(huì)對(duì)大鼠認(rèn)知功能造成短暫性損害，導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶能力下降，其機(jī)制與大鼠海馬組織中炎癥因子及MMP-9基因表達(dá)升高、BDNF基因表達(dá)降低有關(guān)。本研究的創(chuàng)新之處，不僅確定了ISO對(duì)神經(jīng)功能的影響，還從分子水平和基因水平解釋了ISO影響神經(jīng)功能機(jī)制，具有重要的意義。