耐多藥結核患者外周血Th1、Th2、Th17細胞及其細胞因子水平變化

葉靜，吳琦，杜鐘珍，梅早仙，侯志麗，李志華，孫海柏

(天津市海河醫院，天津300350)

結核病是對人類健康危害嚴重的呼吸系統傳染性疾病，已成為了世界范圍內關注的公共衛生問題和社會性問題。我國結核病發病率位居世界第2位，目前實施的結核病防治規劃獲得良好效果，但結核病發病與死亡人數在法定報告傳染性疾病中仍占首位，這與耐藥結核關系密切[1]。研究顯示，結核主要是T淋巴細胞特異性介導細胞免疫反應，因此臨床研究重點聚焦在細胞免疫分析。Th1主要介導人體細胞免疫，可以分泌干擾素γ(IFN-γ)等細胞因子；Th2則主要介導體液免疫反應，可以分泌白細胞介素4(IL-4)、IL-5等細胞因子；生理情況下兩者處于平衡和協調之中，結核的發生與兩者比例失衡密切相關。Th17則屬于CD4+效應T細胞亞群，不同于傳統研究的Th1和Th2，具備獨立的分化與基質，可以產生IL-17、IL-10等細胞因子。目前，臨床對于耐多藥結核(MDR-TB)患者中上述細胞亞群及其細胞因子的報道較少見[2]。本研究分析了MDR-TB患者外周血Th1、Th2、Th17細胞及其細胞因子水平變化，以期為臨床提供指導和依據。現報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2017年1月～2018年12月在天津市海河醫院治療的無耐藥肺結核患者67例(肺結核組)、MDR-TB患者45例(MDR-TB組)。納入標準：①肺結核診斷符合《肺結核診斷和治療指南》中的標準，MDR-TB符合《耐多藥肺結核診斷和治療指南》中的標準；②無HIV、HBV等其他傳染病病原合并感染。排除標準：①近3個月使用過激素、免疫抑制劑等藥物；②合并有糖尿病、高血壓、肝腎功能障礙、血液系統異常、自身免疫系統疾病、惡性腫瘤等；③妊娠期或哺乳期婦女。肺結核組男38例、女29例，年齡(30.92±7.83)歲；MDR-TB組男25例、女20例，年齡(31.01±8.50)歲。同時選取健康志愿者80例作為對照組，男50例、女30例，年齡(31.15±8.46)歲。各組性別、年齡具有可比性。本研究經醫院醫學倫理委員會批準，患者及家屬知情同意。

1.2 Th1、Th2、Th17細胞及相應細胞因子檢測方法 各組均采集空腹靜脈血4 mL，離心(4 000 r/min)后提取血清進行分裝，置-80 ℃冰箱備用。采用流式細胞儀測定Th1、Th2和Th17，選擇單個核細胞后加熒光抗體避光孵育，應用PBS緩沖液沖洗，加入破膜劑，避光孵育5 min開始檢測。熒光抗體均由Santa Cruz公司提供，按照說明書操作。ELISA法檢測Th1細胞因子IFN-γ、Th2細胞因子IL-4和IL-5、Th17細胞因子IL-17和IL-10，試劑盒購自Camilo公司，按說明書操作。

2 結果

2.1 各組外周血Th1細胞及相應細胞因子比較 MDR-TB組外周血Th1細胞和IFN-γ水平低于對照組(P均<0.05)，與肺結核組比較差異無統計學意義。見表1。

表1 各組外周血Th1細胞及相應細胞因子比較

注：與對照組比較，*P<0.05。

2.2 各組外周血Th2細胞及相應細胞因子比較 MDR-TB組外周血Th2細胞和IL-4、IL-5水平低于對照組(P均<0.05)，與肺結核組比較差異無統計學意義。見表2。

表2 各組外周血Th2細胞及相應細胞因子比較

注：與對照組比較，*P<0.05。

2.3 各組外周血Th17細胞及相應細胞因子比較 MDR-TB組外周血Th17細胞和IL-10、IL-17水平高于對照組和肺結核組(P均<0.05)，肺結核組外周血Th17細胞和IL-10、IL-17水平高于對照組(P均<0.05)。見表3。

表3 各組外周血Th17細胞及相應細胞因子比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與肺結核組比較，#P<0.05。

3 討論

結核病是世界范圍內主要的傳染性疾病之一，病死率較高。有報道稱，全球己有1/3的人群感染結核菌，每年新發病例800～1 000萬[3]。隨著現代醫學飛速發展，越來越多的抗結核治療藥物在臨床廣泛應用，有效控制了結核病泛濫；但是，隨著不合理用藥等情況出現，造成了結核分枝桿菌耐藥增加[4]。有報道認為，由于人類免疫缺陷病毒的感染流行和人群免疫水平低下等情況，結核分枝桿菌耐藥性明顯加重。有報道稱，在世界范圍內20億感染結核菌人群中，感染耐藥結核分枝桿菌者約有500萬人，其中感染MDR-TB患者占耐藥結核菌患者的1/5[5，6]。耐藥是由于基因突變導致藥物對突變菌的效力降低造成的，耐多藥結核菌株的自然發生頻率很低；因為病灶內出現同時耐兩種或兩種以上藥物的野生突變株幾乎不存在，所以耐藥菌株的播散是造成新耐藥患者的主要來源，也是重癥肺結核在臨床難治的重要原因之一[7]。研究還發現，復治肺結核患者耐藥越來越顯著，也是結核病防治工作中需要解決的重要問題。耐藥性關乎治療成敗，而其影響因素復雜，通過對患者體內免疫水平變化進行分析并了解對MDR-TB患者病情的影響，對于提高治愈率是十分必要的[8，9]。

傳統T細胞分類按照表面抗原差異分為輔助性T細胞與抑制性T細胞，近年來按照細胞因子產生模式與生物學功能則分為Th1、Th2和Th17。Th1可以產生IL-2、IFN和TNF，Th2則可以產生IL-4、IL-5等。輔助性T細胞可以介導細胞免疫以及細胞毒T細胞的生長與活化，因此對細胞內寄生菌的感染具有抑制作用。有研究發現，采用原位雜交法觀察到蕈樣肉芽腫患者Th1細胞中IL-2、IFN表達明顯增多[10]；IFN則主要刺激體液免疫并促進B細胞增殖過程，可以分泌IL-4、IL-5等誘導肥大細胞與嗜酸性粒細胞分化和增殖[11]。研究表明，MDR-TB發生與Th細胞亞群失衡關系密切。研究發現，結核患者體內Th1型細胞因子低下，但Th2型細胞因子未見差異，考慮MDR-TB久治不愈可能與Th1細胞反應低下有一定關系[12]。有學者認為，以Th1細胞為主的細胞免疫功能下降和以Th2 細胞為主的體液免疫功能下降是造成結核分枝桿菌感染產生耐多藥的重要原因之一。近年來大量研究發現，Th17細胞也參與到結核免疫應答與調控過程中，其分泌的促炎因子IL-17可促進中性粒細胞的分化與轉移，因此在加速對結核分支桿菌二次應答與清除中具有重要意義[13]。有學者還發現，隨著疾病嚴重程度加重、結核病灶范圍增大或出現空洞，外周血Th17水平會降低，說明人體免疫機能抑制加重。在這一過程中，由于IL-17轉錄受阻會導致初始的T細胞發生轉化，無法形成有效的保護性免疫反應[14]。MDR-TB患者由于體內細胞免疫機能長期被抑制，被結核分支桿菌抗原刺激時間長，因此形成的變化更顯著。內源性的轉化因子β以及IL-6等均會造成IL-17表達增加，介導炎癥細胞到局部浸潤并造成組織損傷[15]。對結核患者開展支氣管肺泡灌洗發現，MDR-TB患者IL-17水平高于普通結核患者與對照人群。這表明Th17細胞分泌IL-17可能參與MDR-TB發病過程，為臨床彌補了傳統Th1/Th2介導效應中的不足，為早期診治MDR-TB提供可能的新靶點。

本研究顯示，MDR-TB組Th1細胞和IFN-γ水平低于對照組，而與肺結核組比較差異無統計學意義，說明在結核患者體內Th1細胞和IFN-γ水平明顯降低。MDR-TB組Th2細胞和IL-4、IL-5水平低于對照組，而與肺結核組比較差異無統計學意義，說明在結核患者體內Th2細胞和IL-4、IL-5水平降低。MDR-TB組Th17細胞和IL-10、IL-17高于對照組和肺結核組，肺結核組高于對照組；這說明在結核患者體內存在Th17細胞和IL-10、IL-17水平升高，而在MDR-TB患者體內則升高更顯著。由上可見，MDR-TB及肺結核患者Th1、Th2細胞及相應細胞因子降低，Th17細胞及相應細胞因子升高，其中Th17細胞及相應細胞因子在MDR-TB發病中有一定作用。本研究優勢在于證實了MDR-TB患者體內存在細胞免疫功能異常，而且Th17細胞對于MDR-TB具有一定的鑒別意義，為臨床尋找可靠的血清學指標區別MDR-TB提供了理論基礎。但是，本研究納入患者數量有限，隨訪時間短，因此還需長期隨訪、擴充樣本量深入研究論證。