人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞尾靜脈注射移植對(duì)圍絕經(jīng)期大鼠血清LH和INHB水平的影響

毛邱嫻，佘昊清，李嘉，尹春艷

(廣東省第二人民醫(yī)院,廣州510317)

近年來有研究發(fā)現(xiàn)，圍絕經(jīng)期綜合征的發(fā)病年齡有年輕化趨勢(shì)，發(fā)病率也有所上升，成為影響中老年婦女生活質(zhì)量的重要疾患之一。卵巢功能衰退是圍絕經(jīng)期綜合征發(fā)生的重要原因，黃體生成素(LH)、抑制素B(INHB)是反映卵巢功能的重要性激素指標(biāo)。近期研究發(fā)現(xiàn)，人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(hUCMSCs)移植對(duì)壓力性尿失禁、子宮內(nèi)膜疾病、卵巢早衰等婦科疾病的治療有較好效果。2016年7～12月，我們將hUCMSCs移植入圍絕經(jīng)期SD大鼠體內(nèi)后，檢測(cè)移植前后大鼠血清LH、INHB水平變化，評(píng)估該細(xì)胞對(duì)圍絕經(jīng)期卵巢功能的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象 13～15月齡SD健康雌性大鼠40只，體質(zhì)量410～450 g；3～6月齡SD健康雌性大鼠15只，體質(zhì)量280～320 g；研究對(duì)象均由廣東省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(粵)2009-0003,自然條件下喂養(yǎng)，食水自取。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 hUCMSCs的傳代與擴(kuò)增 hUCMSCs原代細(xì)胞購于重慶華雅干細(xì)胞技術(shù)有限公司，置于適宜的環(huán)境進(jìn)行保存；對(duì)細(xì)胞進(jìn)行沖洗、胰蛋白酶消化，用完全培養(yǎng)基進(jìn)行消化終止。離心、去除上清后，用完全培養(yǎng)基重懸，以1∶3進(jìn)行傳代；當(dāng)細(xì)胞總數(shù)達(dá)到2×107個(gè)(細(xì)胞保證7代內(nèi))，將細(xì)胞配成1×106/mL的單細(xì)胞懸液備用。

1.2.2 圍絕經(jīng)期大鼠的選取 40只13～15月齡SD大鼠編號(hào)后，于每日8:00行陰道周期涂片檢測(cè)，顯微鏡下觀察并記錄動(dòng)情周期[1]。將出現(xiàn)動(dòng)情周期紊亂或動(dòng)情周期時(shí)間延長，如持續(xù)動(dòng)情期、持續(xù)動(dòng)情間期、無動(dòng)情周期的大鼠納入圍絕經(jīng)期[2，3]。

1.2.3 動(dòng)物分組及hUCMSCs移植 將動(dòng)情周期紊亂的30只大鼠隨機(jī)分為A、B組各15只，分別于尾靜脈注射移植液PBS、hUCMSCs(1×106/mL) 1 mL,隔日1次，共2次。15只3～6月齡(青年期)SD健康雌性大鼠(C組)作為對(duì)照，不予任何處理。

1.2.4 血清LH、IHNB檢測(cè) 在成模時(shí)(移植前)及移植后2、3、4周時(shí)，分別于各組大鼠眼眶內(nèi)眥靜脈采血2 mL，放入4 ℃離心機(jī)(1 000 r/min×15 min)離心，將血清吸出移入EP管，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆茫徊捎肊LISA法檢測(cè)血清LH、INHB，操作流程按照說明書進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 各組血清LH水平比較 見表1。

表1 各組血清LH水平比較

注：與同組移植前比較，aP<0.05；與C組同時(shí)點(diǎn)比較，bP<0.05；與A組同時(shí)點(diǎn)比較，cP<0.05。

2.2 各組血清INHB水平比較 見表2。

表2 各組血清INHB水平比較

注：與同組移植前比較，aP<0.05；與C組同時(shí)點(diǎn)比較，bP<0.05；與A組同時(shí)點(diǎn)比較，cP<0.05。

3 討論

干細(xì)胞移植在現(xiàn)代臨床治療手段當(dāng)中具有重要價(jià)值，對(duì)器官的衰老、不可逆損傷、難治性疾病有重要影響[4]。近幾年來，hUCMSCs因具有細(xì)胞易獲得，感染率、免疫原性低，培養(yǎng)方便，無倫理限制等優(yōu)勢(shì)，在各治療手段當(dāng)中備受關(guān)注。

間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)于1966年在骨髓中被發(fā)現(xiàn)，此細(xì)胞在特殊條件下可分化為肌腱、韌帶等細(xì)胞，其自我更新、增殖、多項(xiàng)分化潛能已得到認(rèn)可[5]。hUCMSCs同樣具有定向分化潛能，且“可塑性”不亞于骨髓MSCs，同樣可定向分化為體內(nèi)多種細(xì)胞[6]。在生物學(xué)特性上，hUCMSCs主要以貼壁生長為主，原代培養(yǎng)72 h后常呈成纖維細(xì)胞形態(tài)，胞質(zhì)豐富，核大，3～4 d可進(jìn)行傳代，傳代至20代后仍可維持細(xì)胞原有形態(tài)[7]。付霞霏等[8]將自身免疫性卵巢早衰小鼠移植hUCMSCs后，移植組早衰小鼠體內(nèi)雌激素高于對(duì)照組、卵泡刺激素(FSH)低于對(duì)照組，鏡下卵巢組織也有所改善，認(rèn)為hUCMSCs可有效改善早衰小鼠卵巢功能。在俞凌[9]的研究中，將hUCMSCs移植入雌性卵巢早衰小鼠體內(nèi)，移植后小鼠卵巢內(nèi)卵泡數(shù)目及質(zhì)量均有效提高，細(xì)胞凋亡數(shù)目明顯減少。Sun等[10]建立了環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的卵巢早衰大鼠模型，移植hUCMSCs能增加激素分泌和卵泡發(fā)生，并減少卵巢細(xì)胞凋亡。這些研究表明hUCMSCs在卵巢早衰治療中有效，該結(jié)論也得到其他研究者的支持[11]。

卵巢周期性排卵的改變是女性生殖內(nèi)分泌的特征。LH刺激體內(nèi)雌激素分泌，促進(jìn)卵泡成熟和排卵。臨床研究中，女性卵巢功能逐漸衰退，儲(chǔ)備功能下降，體內(nèi)雌激素分泌量減少，導(dǎo)致LH水平升高；高水平LH可刺激卵泡分泌雌激素，使女性內(nèi)分泌的激素變化有效循環(huán)。若雌激素仍處于低水平狀態(tài)，垂體負(fù)反饋減少，可進(jìn)一步升高LH；隨著時(shí)間的推移，卵巢周期性激素變化失衡，卵泡發(fā)育逐漸抑制，最終進(jìn)入絕經(jīng)期[12]。

本實(shí)驗(yàn)采用正常衰老大鼠作為模型，再現(xiàn)卵巢衰老狀態(tài)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),A、B組成模時(shí)圍絕經(jīng)期大鼠血清LH水平均高于C組，A、B組間移植前差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明圍絕經(jīng)期大鼠體內(nèi)LH處于較高表達(dá)狀態(tài)。于移植后2、3、4周再次檢測(cè)LH，A組隨時(shí)間推移較移植前均有升高，表明A組卵巢功能進(jìn)一步進(jìn)入衰老；B組移植后2周血清LH水平低于A組，提示在hUCMSCs移植后2周就能改善卵巢分泌LH水平。胡佳佳等[13]研究發(fā)現(xiàn)，hUCMSCs移植圍絕經(jīng)期大鼠2周后電鏡下卵巢結(jié)構(gòu)改善，本研究結(jié)果與之相符，提示hUCMSCs可延緩圍絕經(jīng)期大鼠卵巢衰老。移植后3、4周，B組血清LH水平仍低于同時(shí)點(diǎn)A組，表明hUCMSCs移植3、4周后仍有改善卵巢功能的效果。B組移植后2、3、4周仍高于同時(shí)點(diǎn)C組，表明hUCMSCs雖能有效緩解卵巢的衰老，但能否使其卵巢功能恢復(fù)到青年期大鼠水平，仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。

近年來，INHB在臨床中對(duì)預(yù)測(cè)女性卵巢儲(chǔ)備功能有著越來越重要的位置。該蛋白對(duì)FSH有調(diào)節(jié)作用，在卵巢儲(chǔ)備功能減退時(shí)該蛋白能早于FSH發(fā)生變化。因此，有學(xué)者認(rèn)為將血清INHB水平作為預(yù)測(cè)卵巢儲(chǔ)備功能的直接指標(biāo)[14]。Zhang等[15]以卵巢早衰大鼠為研究對(duì)象，將hUCMSCs經(jīng)靜脈注射或植入卵巢后第14、30天，大鼠卵巢內(nèi)卵泡數(shù)目、激素水平有明顯提高。我們前期研究中發(fā)現(xiàn)，將自然衰老的圍絕經(jīng)期大鼠體內(nèi)移植hUCMSCs，第14天血清AMH、INHB水平較給予PBS大鼠升高，表明hUCMSCs可改善自然衰老的圍絕經(jīng)期大鼠卵巢儲(chǔ)備功能[15]。本研究結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)成模時(shí)A、B組圍絕經(jīng)期大鼠體內(nèi)INHB激素水平均低于C組，兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；在移植后2、3、4周A組血清INHB水平較移植前降低，表明隨時(shí)間推移其卵巢功能逐漸衰老。而B組在移植后2、3、4周血清INHB水平均較移植前升高，且高于同時(shí)點(diǎn)A組水平。這提示hUCMSCs能有效改善大鼠卵巢功能，且持續(xù)至4周仍然有效，與胡佳佳等[13]研究結(jié)果相似。B組移植后2、3、4周血清INHB水平仍低于同時(shí)點(diǎn)C組，再次表明hUCMSCs雖能有效緩解卵巢的衰老，但未能使其卵巢功能恢復(fù)到青年期大鼠水平。有研究發(fā)現(xiàn)，將干細(xì)胞移植入化療導(dǎo)致的卵巢早衰小鼠體內(nèi)，能使其恢復(fù)卵巢功能且完成生育。但是，hUCMSCs能否使圍絕經(jīng)期大鼠恢復(fù)至青年時(shí)期水平，仍需更多實(shí)驗(yàn)加以證明。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，hUCMSCs移植入圍絕經(jīng)期大鼠體內(nèi)后，能有效降低LH水平、提高INHB水平，在移植后2～4周均有效果；而未移植大鼠隨時(shí)間推移，其卵巢功能逐漸走向衰老。因此，我們認(rèn)為hUCMSCs移植可改善圍絕經(jīng)期大鼠的卵巢功能，提高了其卵巢的貯備能力，雖不能使其卵巢功能達(dá)到青年期大鼠卵巢水平，但能有效延緩卵巢功能衰老。與青年期大鼠激素水平的差距是否與注射次數(shù)及注射劑量有關(guān)，仍需我們今后進(jìn)一步加以驗(yàn)證。