膀胱癌組織、細胞中長鏈非編碼RNAs H19表達變化及其對細胞增殖的影響和機制

郭宗華，孔東波，江波濤，鄒偉，饒志剛，趙克棟

(咸寧市中心醫(yī)院 湖北科技學(xué)院附屬第一醫(yī)院，湖北咸寧437100)

膀胱癌是全球最常見的惡性腫瘤之一，膀胱癌進展與腫瘤的惡性增殖密不可分，wnt/β-catenin信號通路在腫瘤細胞增殖中起重要作用。大量研究表明，膀胱癌發(fā)病機制是由遺傳和表觀遺傳改變的累積引發(fā)的復(fù)雜過程。長鏈非編碼RNAs (LncRNAs)屬于非編碼RNA，在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達變化，參與調(diào)控腫瘤的惡性生物學(xué)行為。H19是一種LncRNAs，是腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素[1]。有研究認為，H19是一種促癌因子，與腫瘤的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和耐藥等均密切相關(guān)[2～5]。2016年6月～2018年6月，我們觀察了H19在膀胱癌組織及細胞中的表達變化，并探討其對膀胱癌細胞增殖的影響及作用機制，旨在為H19作為膀胱癌潛在治療靶點提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

1.1.1 膀胱癌組織 收集2016年12月～2017年12月入住我院行手術(shù)切除的膀胱癌患者40例，標本收集前未行任何抗腫瘤治療，未合并其他腫瘤、傳染病?；颊吣?9例、女11例，年齡(54.39±14.98)歲，腫瘤分期T1～T2期27例，T3～T4期13例，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移16例，行膀胱部分切除術(shù)23例、根治性切除術(shù)17例，組織學(xué)分級低分化18例、高分化22例。另取同一時段良性膀胱疾病行手術(shù)切除的正常膀胱組織20例，患者中男11例、女9例，年齡(57.02±18.21)歲。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準，患者均簽署知情同意書，兩組性別、年齡具有可比性。組織均經(jīng)兩位及以上病理專家確診，切除的組織標本立即保存于-80 ℃液氮中。

1.1.2 細胞與試劑、儀器 人膀胱癌細胞EJ、T24、 J82和人正常膀胱上皮細胞SV-HUC-1均購自美國ATCC細胞庫；RPMI1640、DMEM-F12培養(yǎng)基、FBS購自美國Gibco公司；H19、內(nèi)參GAPDH引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成；PrimeScriptTMRT Reagent Kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Premix Ex TaqTMqRT-PCR試劑盒等均購自日本TaKaRa公司；H19 siRNA(si-H19)和陰性對照siRNA (si-NC)購自廣州瑞博公司；MTS購于南京凱基生物技術(shù)有限公司；流式周期檢測試劑購自齊一生物科技有限公司；蛋白裂解試劑、蛋白濃度BCA檢測試劑購自美國Thermo公司；wnt/β-catenin信號通路相關(guān)蛋白β-catenin、Cyclin D1、cMYC抗體均自英國Abcam公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 膀胱癌組織和細胞中H19檢測 采用qRT-PCR法。以TRIzol裂解液氮凍存的組織以及膀胱癌細胞、正常膀胱上皮細胞，提取其總RNA。測定RNA濃度后，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA；以cDNA為模板，按SYBR Premix Ex TaqTMqRT-PCR試劑盒說明進行PCR擴增。引物序列：H19上游5′-ATCGGTGCCTCAGCGTTCGG-3′、下游5′-CTGTCCTCGCCGTCACACCG-3′，GAPDH上游5′-ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3′、下游5′-GCCATCACGCCACAGTTTC-3′。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 s，95 ℃變性5 s、60 ℃退火30 s，共40個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量。實驗重復(fù)3次，取平均值。

1.2.2 細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 選取H19表達最高的膀胱癌細胞，接種于含10% FBS的RPMI1640培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2全濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將呈對數(shù)生長的細胞鋪至6孔板，細胞融合至90%左右時，隨機分為抑表達組和對照組，用脂質(zhì)體2000分別轉(zhuǎn)染si-H19、si-NC，放至培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.3 細胞增殖能力觀察 采用MTS法。轉(zhuǎn)染48 h后收集細胞，用胰酶消化；以1.5×103/孔接種96孔板，每組設(shè)6個平行復(fù)孔，置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；48 h時每孔加入100 μL培養(yǎng)基和20 μL MTS工作液，繼續(xù)孵育2 h，以全波長掃描儀檢測490 nm波長處的吸光度(OD值)。細胞增殖率=(1-實驗組OD值/對照組OD值)×100%

1.2.4 細胞克隆形成能力觀察 采用平板克隆形成實驗。轉(zhuǎn)染48 h后收集細胞，用胰酶消化；以2×102/孔接種于6孔板，每組設(shè)3個平行復(fù)孔，置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；培養(yǎng)1周時再次轉(zhuǎn)染，2周左右肉眼可觀察到細胞克隆團；棄去培養(yǎng)基，以PBS洗3次；甲醇固定細胞15 min，晾干后加入蘇木素染色30 min；晾干后掃描拍照，計數(shù)肉眼可見克隆團。

1.2.5 細胞周期檢測 轉(zhuǎn)染48 h后收集細胞，用胰酶消化后PBS洗3次；以1×106/管加入預(yù)冷的80%乙醇中固定24 h，每組設(shè)3個平行復(fù)孔；PBS洗3次后，按照流式周期檢測試劑盒說明書加入PI染色液，置于37 ℃培養(yǎng)箱中避光孵育30 min，上流式細胞儀分析各期細胞比例。

1.2.6 細胞中wnt/β-catenin信號通路相關(guān)蛋白檢測 采用Western blotting法。轉(zhuǎn)染48 h后收集細胞，棄掉培養(yǎng)基；PBS洗3次后，加入RIPA蛋白裂解液；將細胞刮下后轉(zhuǎn)移至EP管中，超聲完全裂解后以12 000 r/min、4 ℃離心30 min；取上清，以BCA檢測蛋白濃度；取50 μg蛋白上樣，行SDS-PAGE電泳分離蛋白；濕轉(zhuǎn)后，5% BSA室溫封閉非特異蛋白2 h；加入一抗稀釋液，4 ℃孵育過夜；TBST洗膜，二抗室溫孵育1 h；ECL法曝光條帶，用Quantity One V4軟件分析蛋白條帶灰度值，以目的蛋白與內(nèi)參GAPDH灰度比值表示目的蛋白相對表達量。

2 結(jié)果

2.1 膀胱癌組織中H19表達及其與臨床病理特征的關(guān)系 H19在膀胱癌組織中相對表達量為1.28±0.44，高于正常膀胱組織的0.99±0.28(P<0.01)。膀胱癌組織中H19表達水平與臨床病例特征的關(guān)系,見表1。

表1 膀胱癌組織中H19表達水平與臨床病例特征的關(guān)系

2.2 膀胱癌細胞、正常膀胱上皮細胞中H19表達比較 H19在人膀胱癌細胞EJ、T24、J82中相對表達量分別為4.03±1.17、9.17±1.04、3.17±0.38，均高于人正常膀胱上皮細胞SV-HUC-1中的1.00±0.02(P均<0.05)，選取H19表達水平最高的T24細胞用于后續(xù)實驗。

2.3 H19降表達對膀胱癌細胞增殖活性的影響 抑表達組細胞增殖率為31.85%±3.49%，低于對照組的100.00%±7.00%(P<0.05)。

2.4 H19降表達對膀胱癌細胞克隆形成能力的影響 抑表達組細胞克隆形成數(shù)為(56.32±10.66)個，少于對照組的(95.69±13.65)個(P<0.05)。

2.5 H19降表達對膀胱癌細胞周期的影響 見表2。

表2 H19降表達對膀胱癌細胞周期的影響

注：與對照組比較，*P<0.05。

2.6 H19降表達對膀胱癌細胞wnt/β-catenin信號通路相關(guān)蛋白表達的影響 見表3。

表3 H19降表達對膀胱癌細胞wnt/β-catenin信號通路相關(guān)蛋白表達的影響

注：與對照組比較，*P<0.05。

3 討論

目前，靶向治療在其他腫瘤中的治療已成為標準。雖然，atezolizumab已經(jīng)批準用于膀胱癌的靶向治療[6]，但數(shù)量有限。因此，膀胱癌潛在治療靶點的研究十分迫切?；蚪M中僅有2%的序列可以編碼蛋白質(zhì)，其余均為非編碼RNAs。LncRNAs是一類新的非蛋白轉(zhuǎn)錄本，長度超過200個堿基，A其與miRNAs功能相似。LncRNAs與多種腫瘤類型相關(guān)，在腫瘤惡性增殖、侵襲轉(zhuǎn)移、耐藥及腫瘤干細胞等生物學(xué)過程中具有重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，LncRNAs可以作為腫瘤治療的藥物靶點抑制腫瘤的惡性進展[7，8]。近年來越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，膀胱癌中存在異常表達的LncRNAs，可能為膀胱癌治療的潛在靶點。

H19屬于最早被鑒定的LncRNAs之一，編碼H19的基因位于11號染色體。H19在胚胎發(fā)生過程中保持較高的表達水平，而在正常條件下出生后的大多數(shù)組織中幾乎檢測不到。H19在哺乳動物的發(fā)育和生長過程中發(fā)揮重要作用[9]，其表達失調(diào)時會導(dǎo)致糖尿病性心肌病、缺血性腦卒中和惡性腫瘤等疾病的發(fā)生[1,10，11]。目前已經(jīng)觀察到，H19廣泛高表達于各種腫瘤組織，為腫瘤促進因子。膀胱癌患者血清外泌體中H19表達水平與健康人和良性疾病患者相比顯著增加，高水平H19與較低的生存率相關(guān)，可作為膀胱癌患者非侵入性診斷和預(yù)后生物標志物[12]。Zhu等[3]報道，與鄰近組織相比，膀胱癌組織中H19表達水平增高，并且與晚期臨床分期及轉(zhuǎn)移相關(guān)；敲低膀胱癌細胞中H19的表達，E-鈣黏蛋白表達增加，轉(zhuǎn)移能力降低。本研究發(fā)現(xiàn)，H19在膀胱癌組織中表達升高，與已有的報道一致；同時發(fā)現(xiàn)，H19表達升高與腫瘤T分期相關(guān)，而與性別、年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、手術(shù)方式、腫瘤分級等均無關(guān)，可能與本研究樣本量小有關(guān)。而且，H19在膀胱癌細胞EJ、T24和J82中表達高于人正常膀胱上皮細胞SV-HUC-1，與在組織中的表達具有一致性。本文采用siRNA干擾T24細胞中H19的表達后，細胞增殖活力及克隆形成能力均降低，細胞周期阻滯在G1期。Lv等[2]報道，敲低膀胱癌細胞中H19的表達可抑制細胞增殖；寧伯彬[4]采用平板克隆實驗同樣發(fā)現(xiàn)，抑制H19表達后膀胱癌細胞克隆形成能力降低；而程卓夫等[5]報道，抑制H19表達后膀胱癌細胞周期阻滯在S期，可能與H19作用的機制不同有關(guān)。

干擾H19的表達，可能通過誘導(dǎo)細胞周期阻滯來抑制膀胱癌細胞增殖，其具體作用機制需進一步研究。在乳腺癌細胞中，H19通過拮抗miR-93-5p的調(diào)控作用，即下調(diào)其靶基因STAT3的表達，進而促進腫瘤細胞增殖[13]。在膀胱癌細胞中，H19可以與miR-29c-3p結(jié)合，降低miR-29c-3p對其靶基因CCND2表達的抑制作用，進而促進細胞增殖[5]。然而，腫瘤細胞增殖與多條經(jīng)典信號通路均相關(guān)，包括STAT3、PI3K/AKT及wnt/β-catenin等信號通路，其中wnt/β-catenin在膀胱癌中是調(diào)控惡性增殖最常見的通路之一[14]。β-catenin是wnt經(jīng)典信號通路的樞紐，其編碼基因CTNNB1位于染色體3p21～22。在正常生理條件下，泛素化蛋白酶體降解β-catenin使其在細胞質(zhì)內(nèi)處于低表達狀態(tài)；當細胞受到相應(yīng)刺激信號時，β-catenin降解減少，細胞質(zhì)中β-catenin增多后轉(zhuǎn)移至細胞核中，促進下游靶基因的激活，發(fā)揮促腫瘤增殖的功能[15]。β-catenin下游包括數(shù)個靶基因，我們發(fā)現(xiàn)抑制H19表達可誘導(dǎo)膀胱癌細胞阻滯在細胞周期G1期，其中β-catenin的靶基因Cyclin D1和cMYC均與G1細胞周期的調(diào)控相關(guān)。Cyclin D1和cMYC表達增多，可促進細胞周期從G1期進入G2期。而本研究抑制膀胱癌細胞中H19表達后，細胞中β-catenin、Cyclin D1和cMYC蛋白表達均降低，表明H19可能通過激活wnt/β-catenin信號通路促進膀胱癌細胞增殖。

綜上所述，H19在膀胱癌組織和細胞中表達升高，與膀胱癌患者腫瘤T分期相關(guān)；降低H19表達后，可通過調(diào)控wnt/β-catenin信號通路抑制膀胱癌細胞增殖。本研究發(fā)現(xiàn)了H19在膀胱癌細胞增殖中新的機制，為H19作為干預(yù)膀胱癌細胞惡性增殖的治療靶點提供新的思路。