CYP11B1和CYP11B2基因多態性與醛固酮瘤發病風險的相關性

黃若輝，康歡，鄒曉峰，張國璽，王保軍，歐陽金芝，馬鑫，張旭，曾慶明，曾曉鵬

(1 贛南醫學院第一附屬醫院，江西贛州341000；2 贛州市立醫院；3 中國人民解放軍總醫院)

原發性醛固酮增多癥(Conn綜合征)是導致繼發性高血壓(SH)最常見的病因，與心血管疾病的發病率和病死率相關。醛固酮瘤(APA)是腎上腺皮質腫瘤中常見的一種有功能的良性腫瘤，是原發性醛固酮增多癥(PA)常見的一種亞型[1]。醛固酮作為APA與其病理生理和臨床表現之間的中介物質，控制其合成的醛固酮合酶主要是由醛固酮合酶(CYP11B2)基因編碼；其在腎上腺皮質的球狀帶中由膽固醇通過系列生化反應轉化而成，其中包括許多羥化反應；催化這些羥化反應的酶是一些特異性的細胞色素P450酶，同時還與合成醛固酮的限速酶類固醇激素合成急性調節蛋白相關[2]。由于CYP11B2基因與編碼11-β羥化酶(CYP11B1)的基因前后排列于人類8號染色體(8q24)，兩基因相似率達到近90%，在功能上也密切相關。我們的前期研究和其他研究提示，CYP11B2和CYP11B1基因多態性可能與APA存在相關性[3，4]。本研究進一步檢測APA患者CYP11B2和CYP11B1基因的其他單核苷酸多態性(SNP)位點，探討此二者基因多態性與APA發病的相關性。現報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2009年5月～2017年6月贛南醫學院第一附屬醫院及中國人民解放軍總醫院泌尿外科接受手術治療的APA患者80例(APA組)，經病史、血生化及B超、CT等檢查診斷為APA，術后經病理檢查證實。選取101例同地區體檢健康者作為對照組，排除腎上腺相關疾病史，均無高血壓家族史、心腦血管疾病史、內分泌疾病史及腫瘤等疾病史，并經B超等檢查排除腎上腺占位，且均無血緣關系。APA組男38例、女42例，年齡(45.10±17.11)歲，漢族，收縮壓(166.10±15.24)mmHg，舒張壓(102.70±15.89)mmHg，血鉀(2.46±0.51)mmoL/L；對照組男48例、女53例，年齡(49.00±11.19)歲，漢族，收縮壓(132.00±14.41)mmHg，舒張壓(77.90±8.49)mmHg，血鉀(4.30±0.55)mmoL/L。兩組性別、年齡、民族具有可比性(P均>0.05)，APA組收縮壓和舒張壓均高于對照組而血鉀明顯低于對照組(P均<0.001)。本研究經中國人民解放軍總醫院及贛南醫學院第一附屬醫院倫理委員會批準，研究對象均簽署知情同意書。

1.2 CYP11B1和CYP11B2基因多態性檢測方法

1.2.1 基因組DNA提取 兩組均在清晨7時空腹狀態下抽取外周靜脈血5 mL，EDTA抗凝；利用全血基因組DNA提取試劑盒(北京天根公司)提取外周血基因組DNA，-80 ℃保存備用。

1.2.2 多態性位點選擇 根據相關文獻和公共SNP數據(http://ncbi.nlm.nih.gov/SNP/和http://www.hapmap.org/)選擇CYP11B2和CYP11B1基因中頻數≥0.05，或文獻報道與高血壓病相關的SNP位點共7個(CYP11B1基因rs5301、rs6471570， CYP11B2基因rs3802228、rs3802230、rs4545、rs4546、rs6433)。

1.2.3 基因多態性檢測 采用實時熒光定量聚合酶鏈式反應(real-time PCR)TaqMan-MGB 探針法檢測CYP11B1基因rs5301、rs6471570和CYP11B2基因rs3802228、rs3802230、rs4545、rs4546、rs6433 SNP位點。引物和探針均由美國Applied Biosystems公司設計并合成，利用ABI7500 real-time PCR系統進行PCR擴增。各位點基因多態性的PCR反應體系總量皆為20 μL，每個反應體系DNA含量約為15 ng。PCR擴增循環條件：95 ℃ 10 min，92 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共40個循環。應用美國Applied Biosystems公司SDS軟件對各個等位基因差異進行基因分型。隨機選取約10%的樣本進行DNA測序，基因型符合率100%。

1.2.4 統計學方法 采用SHEsis在線平臺進行Hardy-Weinberg平衡檢驗，Haploview4.0軟件進行連鎖不平衡(LD)分析，SNPassoc1.9-2進行基因型分析，Haplo Stats2.17.0軟件進行單體型重建，SPSS14.0軟件和R statistics program 3.1.2程序包進行統計學處理。計數資料以百分率表示，組間比較行χ2檢驗和Logistic檢驗，比值比(OR)及其95%可信區間(CI)表示相對風險度。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CYP11B1、CYP11B2基因SNP位點的Hardy-Weinberg平衡及LD分析結果 對照組中所選7個位點中除rs3802230外均符合Hardy-Weinberg平衡(P均>0.05)，rs5301、rs6471570、rs3802228、rs3802230、rs4545、rs4546、rs6433所對應P分別為0.46、0.15、0.94、0.01、0.44、0.23、0.38；LD強度以D′值表示，rs3802230與rs3802228間的LD強度最大(D′=0.910)，而rs4545與rs6471570間的LD強度最弱(D′=0.220)。

2.2 兩組CYP11B1、CYP11B2基因SNP位點等位基因、基因型分布比較 APA組CYP11B1基因rs5301位點的A等位基因和CYP11B2基因rs3802228位點的A等位基因、rs6433位點的G等位基因頻率均高于對照組(P均<0.05)，見表1；將性別、年齡及BMI校正后，APA組CYP11B2基因rs4545位點AG基因型頻率低于對照組(P<0.05)，而純合子GG基因型差異無統計學意義。見表2。

表1 兩組CYP11B1、CYP11B2基因SNP位點等位基因分布比較

表2 兩組CYP11B1、CYP11B2基因SNP位點基因型分布比較

注：a為按性別、年齡及BMI校正后。

2.3 兩組CYP11B2、CYP11B1基因SNP位點單體型分布比較 單體型中各位的順序為rs5301、rs6471570、rs3802228、rs3802230、rs6433、rs4545、rs4546，頻率>3%的單體型有GCACAAC、GAACAAC、GCGAAGT、GCACAGC，其中APA組GAACAAC、GCGAAGT頻率低于對照組(P=0.012，OR=0.73，95%CI為0.57～0.93；P=0.012，OR=0.81，95%CI為0.69～0.95)。見表3。

3 討論

研究表明，APA與多個基因、多個通路的異常存在關聯(如Wnt/β-catenin、KCNJ5等)，同時還可能有長鏈非編RNA參與調控相關基因[5,6]，而本文僅就多態性進行進一步研究。研究發現，漢族人群CYP11B2基因多態性位點rs3802230與血壓存在關聯，且該位點C等位基因與高血壓易感性呈正相關；rs4546與-344C/T組成的單體型與APA發病率存在關聯，并影響血壓；進一步研究發現，醛固酮可通過rs3802228、rs6433發揮作用，與高血壓患者心臟功能改變有關，且rs6433與醛固酮代謝有關。在選擇部分已報道位點進一步驗證的同時，我們通過公共SNP數據選擇CYP11B1基因rs5301、rs6471570多態性位點進行研究。

表3 兩組CYP11B2、CYP11B1基因SNP位點單體型分布比較

注：a為按性別、年齡及BMI校正后。

Barr等[7]發現，CYP11B2基因-344T、intron2C可以增加APA的發病風險。在單體型研究中發現，由CYP11B2基因多態性位點組成的-344T/173K單體型相對于其他單體型CYP11B2基因表達呈上調趨勢，與原發性高血壓(EH)有關，并影響醛固酮的合成。部分研究發現，CYP11B1基因多態性(如rs6410等)與EH患者的相關性是通過CYP11B1活性的降低、醛固酮合成增加來實現的[8]。Barr等[7]研究格拉斯哥人群發現，Conn綜合征患者中CYP11B2基因含-344T等位基因、intron2W/C基因型頻數高于正常人群；推測相關基因型可影響醛固酮的分泌，從而增大APA的患病風險。而且，在APA患者中，含有CYP11B2基因-344T/173K的單體型CYP11B2基因的表達明顯上調。Rossi等[9]研究意大利高血壓人群發現，CYP11B2基因-344C/T位點TT型在低腎素高血壓患者中升高，認為該基因型可能在功能型突變導致的LD中扮演重要作用。在臺灣人群中發現，CYP11B2基因-344T>C含有基因型TT較TC、CC在女性患者存在疾病易感性[10]。McManus等[11]認為，CYP11B2基因多態性的不同基因型可與相關基因作用產生效應，例如APEX1可能是一個抑制作用基因，但這種抑制作用與CYP11B2基因-1651T/C有關。Iwai等[12]選取CYP11B2和CYP11B1基因上35個多態性位點進行分層研究，發現CYP11B2基因-344T>C與其他多態性位點具有較強的LD關系，同時CYP11B2基因rs179998(344T>C)TT基因型相對于TC、CC基因型對鹽皮質激素的更敏感，血壓升高更明顯。王保軍等[13]發現，CYP11B2和CYP11B1基因多態性位點rs179998、rs4539與CYP11B2基因的表達上調存在關聯，單體型如AGAConvT、AGAWtC表達也上調，其中由intron2W/C的C等位基因、rs13268025的C等位基因及rs13268025、rs1799998、intron2W/C、rs4539、rs3097、rs6410、rs6387組成的單體型GAGACTC使得APA發病風險明顯提高。

本研究結果顯示，APA組中CYP11B1基因rs5301位點的A等位基因及CYP11B2基因rs3802228位點的A等位基因、rs6433位點的G等位基因頻率高于對照組，且rs4545位點雜合子AG比例較對照組降低。至于其具體機制，有研究認為，CYP11B2基因和CYP11B1基因部分多態性通過基因轉錄調控影響該基因的表達，改變CYP11B2基因和CYP11B1基因對類固醇合成因子的敏感性，導致CYP11B1活性降低，醛固酮合成增加，從而增加APA發病風險。多個SNP組成的單體型與疾病發生和發展具有相關性,含有CYP11B2基因-344T/173K的單體型APA發病風險明顯增加[14]。本研究發現，GAACAAC、GCGAAGT單體型與APA發病風險具有相關性，但CYP11B2基因rs3802228、rs3802230、rs4546、rs6433和CYP11B1基因rs5301、rs6471570多態性位點其基因型分布頻率在兩組差異無統計學意義。這種結果的差異可能與不同種族的不同遺傳背景和不同種族間基因多態性之間的LD模式不同等因素有關。

總之，CYP11B1基因和CYP11B2基因多態性與APA具有關聯。其中，CYP11B2基因多態性位點rs4545與APA人群有關，且CYP11B2基因和CYP11B1基因組成的單體型GAACAAC、GCGAAGT與APA發病風險呈負相關。