ghrelin對海馬神經干細胞糖氧剝奪性損傷的影響及機制

李燕宏，杜堅，張紅梅，任柏沉，劉愛東

(成都醫學院第一附屬醫院，成都610500)

ghrelin是一種由28個氨基酸組成的新的內源性腦腸肽，具有促生長激素分泌、調節食欲和調節能量代謝的作用[1]。其作用主要是通過生長激素促分泌素受體1a(GHS-R1a)介導，該受體在腦內廣泛分布，提示ghrelin對腦部功能具有重要的調節作用[2]。研究發現，ghrelin對腦缺血-灌注性損傷[3]、創傷性腦損傷[4]、敗血癥并發腦損傷[5]等均具有抑制作用。神經干細胞具有再生能力和定向分化為神經細胞的潛力[6]，有可能參與中樞神經系統損傷與修復過程[7]。近期研究顯示，敲除ghrelin可使小鼠側腦室的室管膜下區的神經干細胞數量減少，而外源性給予ghrelin則增加神經干細胞數量[8]。ghrelin對腦內神經干細胞的調節作用可能構成其保護腦損傷的細胞學基礎，但具體機制并不清楚。核受體輔阻遏子1(N-CoR1)是非配體化核受體的主要結合蛋白。N-CoR1與非配體化的核受體結合，募集并激活組蛋白去乙酰化酶3(HDAC3)，進而抑制靶基因如磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)的表達[9]。研究發現，過表達N-CoR1被可抑制間充質干細胞向脂肪細胞[10]和成骨細胞[11]的分化，沉默N-CoR1則促進間充質干細胞增殖分化；另外，N-CoR1還調節神經膠質母細胞瘤衍生的癌癥干細胞增殖分化過程[12]。但是，N-CoR1是否介導ghrelin對腦內神經干細胞的保護性作用目前尚不清楚。2017年1月～2018年12月，我們制備海馬神經干細胞糖氧剝奪性損傷模型，觀察N-CoR1/PI3K通路在ghrelin保護神經干細胞損傷中的可能作用，為ghrelin用于中樞神經系統損傷的治療提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料 海馬神經干細胞：新生C57BL/6幼鼠海馬神經干細胞由本實驗室參照文獻報道[13]分離培養，采用針對神經干細胞標志分子巢蛋白的免疫熒光檢測鑒定神經干細胞呈現典型巢蛋白陽性。主要藥品及試劑：ghrelin、ghrelin受體拮抗劑D-Lys3-GHRP-6、PI3K抑制劑LY294002、抗N-CoR購自Sigma-Aldrich公司；N-CoR siRNA由銳博生物公司合成，轉染試劑Lipofectamine2000、Alexa Fluor 488熒光標記二抗IgG購自Invitrogen公司。CCK-8檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所。DAPI、BCA試劑盒、RIPA裂解液購自碧云天生物技術研究所。抗PI3K、抗增殖細胞核抗原(PCNA)、抗Bax、抗Bcl-2、抗GAPDH抗體購自美國Cell Signaling技術公司。

1.2 細胞培養 取生長狀態良好的第3代神經干細胞，以1×105/孔接種于24孔板中培養。待細胞融合度達80%左右時，即用于實驗處理。

1.3 細胞分組造模與干預處理 將細胞隨機分為正常對照組、損傷模型組、ghrelin治療組、GHRP組、LY29400組、siRNA空白對照組、N-CoR1 siRNA組。正常對照組更換為正常糖含量的培養基，置于37 ℃正常氧含量混合氣體的普通培養箱中培養24 h。其余各組細胞行糖氧剝奪處理，即是先將24孔板內培養基更換為無糖DMEM/F12培養基，再將培養板放入含1% O2、5% CO2和94% N2厭氧混合氣體的培養箱中，37 ℃缺氧處理3 h；糖氧剝奪處理后，將培養液更換為正常糖含量的DMEM/F12培養基，在通正常氧含量混合氣體的37 ℃普通培養箱中繼續培養24 h。另外，siRNA空白對照組、N-CoR1 siRNA組行糖氧剝奪處理前1 h，培養液更換為含等量轉染溶劑Lipofectamine2000或N-CoR siRNA脂質體(50 nmol/L)的DMEM/F12培養液，轉染持續至糖氧剝奪之后的24 h。ghrelin治療組在糖氧剝奪處理結束后，將培養液更換為含ghrelin(終濃度為100 nmol/L)的DMEM/F12培養基，繼續培養24 h。GHRP組、LY294002組在糖氧剝奪處理結束后，均預先給予10 μmol/L D-Lys3-GHRP-6[14]或20 μmol/L LY294002[15]處理1 h，再同時給予ghrelin處理，繼續培養24 h。為檢測ghrelin對神經干細胞增殖活力的劑量效應關系，CCK-8實驗中ghrelin治療組ghrelin濃度被設置為4、20、100 nmol/L，其余實驗中ghrelin濃度均被設置為100 nmol/L。

1.4 細胞增殖活力觀察 采用CCK-8法。在藥物處理完成后，各組24孔板中每孔保留200 μL培養液，再加入20 μL/孔CCK-8溶液，37 ℃下繼續培養2 h。采用酶標儀(美國Bio-Tek公司)檢測各孔450 nm處吸光值，以此判斷細胞活力。

1.5 細胞中N-CoR1、PI3K、增殖標志蛋白PCNA及凋亡標志蛋白Bax、Bcl-2檢測 采用Western blotting法。藥物處理過程完成后，收集各組細胞；用RIPA裂解液抽取細胞樣本，裂解物經10 %SDS-PAGE分離；電轉至PVDF膜，加脫脂牛奶液封閉1 h；加一抗(抗N-CoR、抗PI3K、抗PCNA、抗Bcl-2、抗GAPDH)4 ℃孵育過夜，洗脫；再加HRP聯接的二抗抗兔IgG(稀釋比1∶500) 孵育1 h，再洗脫；加增強型化學發光試劑，顯示目標蛋白條帶。掃描蛋白條帶圖像，利用Image J軟件分析各條帶的灰度值。Bax/Bcl-2蛋白表達量比值(即凋亡指數)用于衡量細胞凋亡程度，比值越高表示凋亡越強。

2 結果

2.1 ghrelin對糖氧剝脫條件下海馬神經干細胞增殖的影響 與正常對照組(0.99±0.07)比較，損傷模型組(0.68±0.03)海馬神經干細胞增殖活力降低(P<0.01)；與損傷模型組比較，ghrelin治療組隨著ghrelin作用濃度增高(4、20、100 nmol/L分別為0.69±0.04、0.86±0.06、0.97±0.06)海馬神經干細胞增殖活力增高，且20、100 nmol/L ghrelin治療組與之存在統計學意義(P均<0.01)；與ghrelin治療組(100 nmol/L)比較，GHRP組(0.69±0.05)、LY29400組(0.67±0.04)神經干細胞增殖活力降低(P均<0.01)。與siRNA空白對照組(0.67±0.05)比較，N-CoR siRNA組(0.97±0.05)神經干細胞增殖活力增高(P<0.01)。

2.2 ghrelin對糖氧剝脫條件下海馬神經干細胞PCNA和Bax/Bcl-2表達的影響 見表1。

表1 各組海馬神經干細胞PCNA和Bax/Bcl-2表達比較

注：與正常對照組比較，aP<0.01；與損傷模型組比較，bP<0.01；與ghrelin治療組比較，cP<0.01；與siRNA空白對照組比較，dP<0.01。

2.3 ghrelin對糖氧剝脫條件下海馬神經干細胞N-CoR及PI3K表達的影響 見表2。

表2 各組海馬神經干細胞N-CoR及PI3K表達比較

注：與正常對照組比較，aP<0.01；與損傷模型組比較，bP<0.01；與ghrelin治療組比較，cP<0.01；與siRNA空白對照組比較，dP<0.01。

3 討論

隨著當今社會人口的日益老齡化，人群中罹患腦血管意外的老年患者數量不斷增加，這勢必將增加社會與家庭的經濟負擔。因此，深入研究各類腦血管疾病(例如腦梗死)的發生機制并探尋合適的防治方法具有重要意義。

腦梗死是指因腦部血液供應障礙，缺血、缺氧所導致的局限性腦組織的缺血性壞死或軟化。腦梗死的臨床常見類型有腦血栓形成、腔隙性梗死和腦栓塞等，腦梗死占全部腦卒中的80%。腦梗死時，腦部血流的突然停止可導致腦內糖氧剝奪，最終導致神經細胞及其他支持細胞受損，這被認為是腦梗死的重要發病機制[16]。基于此原因，科學家正積極研究通過抑制糖氧剝奪來保護大腦的措施。糖氧剝奪也常被用于體外建立腦梗死模型[17]。事實上，糖氧剝奪不僅會損傷神經細胞，也會損害腦內神經干細胞。本研究結果也證實了這一點，糖氧剝奪抑制了海馬神經干細胞的增殖，促進了細胞凋亡。由此可見，腦梗死時腦內神經干細胞也能因糖氧剝奪而受損，失去參與腦梗死后修復作用的能力。靶向改善這些內源性神經干細胞的功能，無疑對梗死后的神經再生具有重要治療意義。為此，本研究觀察了ghrelin對糖氧剝奪性損傷海馬神經干細胞的保護性作用。結果顯示，ghrelin能顯著改善糖氧剝奪性損傷后海馬神經干細胞的增殖能力和活力，抑制干細胞的凋亡過程。因此，ghrelin可能對維持腦梗死后神經干細胞的神經再生能力具有一定保護作用。

為了進一步探討ghrelin保護海馬神經干細胞抵抗糖氧剝奪性損傷的細胞學機制，本研究探討了N-CoR1及其下游靶基因PI3K與ghrelin保護海馬神經干細胞作用之間的關系。本研究結果顯示，糖氧剝奪性損傷是通過上調N-CoR1和下調PI3K，從而抑制海馬神經干細胞的增殖能力和活力，促進神經干細胞的凋亡過程。相反，ghrelin則通過抑制N-CoR1表達和增強PI3K表達，進而增強海馬神經干細胞的增殖能力和活力，抑制神經干細胞的凋亡過程。現有研究表明，N-CoR1是骨髓間充質干細胞增殖分化的一個負調控因子[10, 11]。N-CoR1還介導神經膠質母細胞瘤衍生的癌癥干細胞增殖分化過程[12]。通過應用N-CoR1 siRNA，本研究則表明N-CoR1調控海馬神經干細胞的增殖與凋亡過程。由此可見，N-CoR1在不同來源的干細胞增殖分化過程中均起著關鍵性作用。另外，N-CoR1的下游分子PI3K調節了骨髓間充質干細胞的增殖分化過程[11]，還介導神經干細胞向神經元的分化。基于上述研究，我們推測，ghrelin對N-CoR1/PI3K通路的調節作用可能與其抑制海馬神經干細胞糖氧剝奪性損傷作用相關。

綜上所述，糖氧剝奪通過調節N-CoR1/PI3K通路而抑制了海馬神經干細胞的增殖和促進神經干細胞凋亡，從而影響其參與腦梗死時神經再生的能力。Ghrelin則通過反向調節N-CoR1/PI3K通路，改善了海馬神經干細胞的增殖活力和抑制神經干細胞凋亡，保護了海馬神經干細胞。