富氫液對化療所致小鼠認知功能障礙的影響及機制

胡南，趙洪偉，張霄蓓，王捷夫

(1天津醫科大學腫瘤醫院 國家腫瘤臨床研究中心，天津300060；2 天津市腫瘤防治重點實驗室；3 天津市惡性腫瘤臨床醫學研究中心)

化療是腫瘤治療最常用的方法之一，接受化療的患者中約有1/3會發生化療所致認知功能障礙(CICI)[1]。5-氟尿嘧啶(5-FU)是臨床常用化療藥物之一，且被證實與CICI的發生相關[2]。認知功能障礙的發生與巨噬細胞的極化有關[3]，巨噬細胞根據其表型可以分為經典活化型巨噬細胞(M1型)和替代活化型巨噬細胞(M2型)，Notch通路可促進巨噬細胞由M2向M1型轉化；M1型極化能引起促炎因子IL-6、IL-1β持續釋放，M2型可通過上調IL-10表達抑制炎癥反應[4]。研究表明，長期飲用富氫液(HRS)具有認知保護作用[5]。Sirtuin-1是一種組蛋白去乙?；?HDAC)，可通過抗炎、抗氧化應激、穩定代謝和染色體等作用對病理狀態下的中樞神經系統進行保護，可作為臨床治療中樞神經系統疾病的新靶點[6]。2018年1～9月，我們觀察了富氫液對5-FU所致小鼠認知功能障礙的影響，并探討Sirtuin-1在其中的作用，為闡明富氫液治療CICI的機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與主要試劑、儀器 健康雄性CD1小鼠270只，8周齡，體質量20～30 g，由中國人民解放軍軍事醫學科學院實驗動物中心提供，實驗獲醫院動物保護和應用委員會批準。2%富氫液：利用GCH300高純度氫氣發生器產生氫氣，采用氫電極法檢測富氫液所含氫氣濃度；探針型分子氫監測儀(美國Unisense A/S公司)，蛋白電泳儀(美國Bio-Rad公司)，臺式離心機(美國Thermo Electron Corpo ration公司)，條件恐懼箱和Y迷宮(XR-XY1032，上海欣軟信息科技有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組與化療處理 采用隨機數字法將小鼠分為對照組(C組)、富氫液組(HRS組)、5-FU組、5-FU+富氫液組(5-FU+HRS組)和5-FU+富氫液+Sirtuin-1抑制劑Nicotinamide組(5-FU+HRS+Nico組)5組各54只。HRS組和5-FU+HRS組、5-FU+HRS+Nico組采用2%富氫液腹腔注射(5 mL/kg，連續注射14 d)，5-FU+HRS+Nico組予富氫液后即行Nicotinamide腹腔注射(30 mg/kg,連續注射14 d)，5-FU組、5-FU+HRS組和5-FU+HRS+Nico組采用5-FU腹腔注射(20 mg/kg，連續注射14 d)。

1.2.2 認知功能觀察

1.2.2.1 恐懼事件認知能力觀察 采用條件恐懼實驗。每組取小鼠15只，放于恐懼箱內適應120 s。給予聲音(20 s，70 dB)作為條件性刺激(CS)，間隔時間25 s；給予足部電擊(2 s，0.7 mA)作為非條件性刺激(US)，電擊停止后間歇60 s。然后進入下一輪，共重復6次。每組分別于藥物處理全部結束后24 h，應用視頻監測分析系統(Any maze系統分析軟件)記錄并分析僵直時間。將動物置于相同的場景環境(訓練期的恐懼箱)中，不給予CS和US，記錄5 min內的僵直時間，以此評價其對恐懼事件認知能力。

1.2.2.2 空間識別記憶能力觀察 采用Y迷宮空間探索實驗。將Y迷宮隨機分為新異臂(N臂)、起始臂(S臂)和其他臂(O臂)，N臂內壁貼上不同圖形以區別于其余兩臂。每組取小鼠15只，實驗包括訓練期和測試期兩個階段。訓練期：擋住N臂，大鼠由S臂放入，在S和O臂自由活動10 min，跳出迷宮者淘汰，訓練結束后放回飼養籠。間隔20 min后，開始檢測期，打開N臂，由相同S臂放入，在3個臂中自由活動5 min；每組分別于藥物處理全部結束后24 h，采用Any-maze視頻軟件追蹤分析系統記錄5 min內大鼠在N臂的停留時間，用以評價大鼠的空間識別記憶能力。

1.2.3 海馬組織中巨噬細胞分型 采用免疫熒光染色法。每組分別于藥物處理全部結束后24 h取小鼠8只，采用脊椎脫臼法處死后取腦組織；分別采用CD11b和CD206標記M1型與M2型巨噬細胞，采用Iba-1標記巨噬細胞。制備新鮮冰凍切片，晾干(5～10 min)；使用4%多聚甲醛固定30 min，由PBS洗脫(5 min×3次)；采用 0.3% Triton破膜30 min，采用PBS洗脫(5 min×3次)；加入解凍BSA或羊血清在37 ℃條件下封閉30 min，再利用5% BSA或羊血清(PBS稀釋)室溫封閉1 h；加入一抗(1∶200)，4 ℃過夜；PBS洗脫后采用二抗(FITC或TRITC，1∶1 000)37 ℃避光1 h，PBS洗脫(5 min×3次)；蓋玻片封片，熒光顯微鏡下觀察。每只動物選取3張腦片，每張腦片選取3個視野觀察海馬CA1區；采用Image J圖像分析系統計算陽性蛋白面積，取均值表示目的蛋白表達。以CD11b或CD206/Iba-1×100%，表示M1型與M2型巨噬細胞。

1.2.4 海馬組織中IL-1β、IL-6、IL-10檢測 采用ELISA法。每組分別于藥物處理全部結束后24 h取小鼠8只，采用脊椎脫臼法處死后取腦組織；采用ELISA法檢測IL-1β、IL-6、IL-10，按照ELISA試劑盒(索萊寶公司)說明書操作。

1.2.5 海馬組織中Sirtuin-1、細胞內Notch受體結構域(NICD)總蛋白和核蛋白檢測 采用Western blotting法。于藥物處理全部結束后24 h，每組取小鼠8只；采用脊椎脫臼法處死后取腦組織，其中雙側海馬一側提取總蛋白、一側提取核蛋白。海馬稱重，加入RIPA緩沖液冰上充分勻漿；4 ℃下以12 000 r/min離心5 min，小心吸取上清液，即為組織總蛋白；提取核蛋白采用超聲約20 s，4 ℃下以13 000 r/min離心15 min,小心吸取上清液，即為組織核蛋白。SDS-PAGE電泳60 min，轉膜1 h；加入兔抗鼠多克隆抗體4 ℃孵育過夜，TBST洗膜5 min×3次；加入羊抗兔二抗，室溫孵育1 h，ECL顯影。應用Image J圖像分析軟件分析目的條帶的灰度值，以目的條帶的灰度值/同一標本的內參灰度值表示靶蛋白的相對表達水平。

2 結果

2.1 各組小鼠5 min內的僵直時間、N臂停留時間比較 與C組比較，5-FU組、5-FU+HRS組和5-FU+HRS+Nico組小鼠5 min內的僵直時間、N臂停留時間縮短(P均<0.05)，HRS組各指標差異無統計學意義(P均>0.05)；與5-FU組比較，5-FU+HRS組小鼠5 min內的僵直時間、N臂停留時間延長(P均<0.05)，5-FU+HRS+Nico組各指標差異無統計學意義(P均>0.05)。見表1。

表1 各組5 min內的僵直時間、N臂停留時間比較

注：與C組比較，*P<0.05；與5-FU組比較，#P<0.05。

2.2 各組小鼠海馬組織中巨噬細胞分型變化 與C組比較，5-FU組、5-FU+HRS組和5-FU+HRS+Nico組海馬組織中M1型巨噬細胞面積增大、M2型巨噬細胞面積減小(P均<0.05)，HRS組各指標差異無統計學意義(P均>0.05)；與5-FU組比較，5-FU+HRS組海馬組織中M1型巨噬細胞面積減小、M2型巨噬細胞面積增大(P均<0.05)，5-FU+HRS+Nico組各指標差異無統計學意義(P均>0.05)。見表2。

表2 各組小鼠海馬組織中巨噬細胞分型變化

注：與C組比較，*P<0.05；與5-FU組比較，#P<0.05。

2.3 各組小鼠海馬組織中IL-1β、IL-6、IL-10表達比較 與C組比較，5-FU組、5-FU+HRS組和5-FU+HRS+Nico組海馬組織中IL-1β、IL-6表達上升而IL-10表達下降(P均<0.05)，HRS組各指標差異無統計學意義(P均>0.05)；與5-FU組比較，5-FU+HRS組海馬組織中IL-1β、IL-6表達下降而IL-10表達上升(P均<0.05)，5-FU+HRS+Nico組上各指標差異無統計學意義(P均>0.05)。見表3。

表3 各組小鼠海馬組織中IL-1β、IL-6、IL-10表達比較

注：與C組比較，*P<0.05；與5-FU組比較，#P<0.05。

2.4 各組小鼠海馬組織中Sirtuin-1、NICD蛋白表達比較 與C組比較，5-FU組、5-FU+HRS組和5-FU+HRS+Nico組海馬組織中Sirtuin-1總蛋白和核蛋白表達均下降而NICD總蛋白和核蛋白表達均升高(P均<0.05)，HRS組各指標差異無統計學意義(P均>0.05)；與5-FU組比較，5-FU+HRS組海馬組織中Sirtuin-1總蛋白和核蛋白表達均升高而NICD總蛋白和核蛋白表達均下降(P均<0.05)，5-FU+HRS+Nico組各指標差異無統計學意義(P均>0.05)。見表4。

表4 各組小鼠海馬組織中Sirtuin-1、NICD蛋白表達比較

注：與C組比較，*P<0.05；與5-FU組比較，#P<0.05。

3 討論

研究表明，臨床常用化療藥物5-FU能夠造成腫瘤患者記憶力、學習力、注意力、推理能力、執行力、集中力和空間感的損害[2]。因此，本研究采用5-FU連續腹腔灌注誘導CICI形成。本研究結果顯示，與C組比較，5-FU組小鼠5 min內的僵直時間、N臂停留時間縮短，提示應用5-FU成功誘導CICI。Liu等[7]研究表明，連續應用2%富氫液可減輕膿毒癥小鼠腦損傷；因此，本研究富氫液用藥濃度采用2%，觀察時點選擇5-FU停用24 h后。本研究結果顯示，與5-FU組比較，5-FU+HRS組小鼠5 min內的僵直時間、N臂停留時間延長，提示2%富氫液可減輕5-FU誘發化療所致認知功能障礙，證實本研究中2%富氫液的給藥方案是有效的。

M1型巨噬細胞和M2型巨噬細胞是巨噬細胞連續變化的兩個極端，并發揮各自的生物學功能[8]。過度或持久的M1型極化能引起機體炎癥反應持續放大，使促炎因子IL-6、IL-1β持續增高，造成炎癥反應綜合征[9]；在組織損傷修復及穩態重建中，M2型巨噬細胞通過高表達IL-10、低表達IL-12抑制炎癥反應，與M1型反應相拮抗，在促進炎癥的消退以及損傷修復中發揮重要作用[10]。而Notch通路作為調節巨噬細胞極化的重要通路之一[11]，通過相鄰細胞的Notch配體與受體相互作用，Notch蛋白經過3次剪切,釋放NICD入胞質；NICD進而轉位進入細胞核,并與核內轉錄因子RBP-Jκ結合,形成NICD/RBP-Jκ轉錄復合體,調控下游靶基因的轉錄表達,發揮包含促炎在內的生物學效應，促進巨噬細胞由M2型向M1型轉化[12]。本研究結果顯示，使用2%富氫液能夠有效降低5-FU造成的Notch通路激活，巨噬細胞向M1型極化以及促炎因子IL-6、IL-1β形成，提示2%富氫液減輕5-FU造成的CICI機制可能與抑制Notch通路激活從而抑制海馬巨噬細胞向促炎型轉化有關。

組蛋白乙酰轉移酶(HAT)催化組蛋白與非組蛋白的乙?；揎棧c基因轉錄激活密切相關；而HDAC則起著催化蛋白質的去乙酰化反應、抑制基因轉錄的作用。目前，在哺乳動物細胞中發現的HDAC亞型已有18種，Sirtuin屬于HDAC3，共有7種亞型[13，14]。研究表明，小膠質細胞缺乏Sirtuin-1將引起小鼠認知功能障礙[15]；Sirtuin-1可通過去乙?；饔靡种芅F-κB，激活蛋白-1、p53等抑制炎癥反應[16]；同時離體實驗也曾發現，Sirtuin-1的去乙?；饔脤otch通路具有負性調節作用，可抑制NICD形成以及轉位進入細胞核啟動的促炎反應[17,18]。本研究結果顯示，2%富氫液在下調NICD的同時上調Sirtuin-1的表達，故我們推測富氫液的抗炎作用與上調Sirtuin-1從而抑制Notch通路有關。為進一步證實Sirtuin-1的這一作用，我們采用了Sirtuin-1的抑制劑Nicotinamide，后者通過非競爭性結合的方式抑制Sirtuin-1的生物活性；結果表明，該藥物的使用阻斷了富氫液對Notch通路的抑制以及巨噬細胞向M2型的極化，從而削弱了富氫液的認知保護作用。這提示2%富氫液對5-FU所致CICI的緩解是通過上調Sirtuin-1從而抑制Notch通路來減輕巨噬細胞向促炎型極化實現的，后期我們將加用Notch通路抑制劑完善這一假設。

綜上所述，富氫液可減輕5-FU化療所致小鼠認知功能障礙，其機制與上調Sirtuin-1表達抑制Notch通路激活，從而抑制巨噬細胞向促炎型轉化有關。