硼酸鈉對人肝癌HepG2細胞Hedgehog信號通路蛋白表達的影響

陳羊，武倫，魏英，周文波，陳琴華，袁方均

(1 錦州醫科大學國藥東風總醫院研究生培養基地,湖北十堰442000；2 湖北醫藥學院附屬東風醫院；3 武當特色中藥研究湖北省重點實驗室)

我國是肝癌高發地區，每年約36.9萬人死于肝癌, 約占全球肝癌死亡總數的47.2%[1]。目前針對肝癌的治療手段有限，總體治療效果并不理想，急需探索新型有效的治療方法。流行病學研究發現，硼的攝入量與肺癌、前列腺癌、乳腺癌的發病率呈負相關。因此，硼在腫瘤治療方面具有重要的研究價值。本課題組前期研究發現，硼酸鈉可抑制人肝癌HepG2細胞的生長活性，但具體作用機制并不清楚。研究發現，Hedgehog信號通路與肝癌細胞增殖密切相關。2018年6月～2019年2月，我們觀察了硼酸鈉對人肝癌HepG2細胞Hedgehog信號通路中Gli2、Ptch1、Cyclin D1蛋白表達的影響，初步探討硼酸鈉抑制HepG2細胞增殖與Hedgehog信號通路之間的關系。

1 材料與方法

1.1 細胞株及主要試劑、儀器 硼酸鈉(天津博迪化工股份有限公司)；人肝癌細胞株HepG2(武漢大學典型培養物保藏中心)，DMEM高糖培養液、胰蛋白酶(Gibco公司)，10%胎牛血清(天杭生物科技有限公司)；TRIzol Reagent(Invitrogen公司)，逆轉錄試劑盒及實時熒光定量PCR(qRT-PCR)試劑盒(Qiagen公司)，PCR引物由上海生工生物有限公司設計并合成；兔抗人Gli2抗體、兔抗人Ptch1抗體、兔抗人Cyclin D1抗體、鼠抗人β-Tubulin抗體、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG、辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG(GeneTex公司) ，BCA蛋白濃度定量測定試劑盒(碧云天公司)；CO2培養箱(Thermo公司)，IX71倒置相差熒光顯微鏡(Olympus公司)，熒光定量PCR儀(RotorGene公司)，電泳儀和半干轉膜儀(Hoefer Inc公司)，UPV INC凝膠成像系統(Gene公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養與分組處理 將HepG2細胞從液氮中取出并解凍，在37 ℃、5% CO2條件下用含10%胎牛血清的DMEM培養液中恒溫培養，每48 h換液1次。待細胞融合度達80%時，用0.25%胰蛋白酶消化貼壁細胞并傳代培養。取處于對數生長期狀態好的細胞，以1×105/孔接種于細胞6孔板中，隨機分為實驗組和對照組。實驗組用含4.0 mmol/L硼酸鈉培養基處理，對照組不處理，兩組均用不含胎牛血清的DMEM培養基培養24 h。

1.2.2 HepG2細胞中Gli2、Ptch1、Cyclin D1 mRNA檢測 采用qRT-PCR法。取各組細胞于1.5 mL EP管中，采用TRIzol試劑提取細胞中的總RNA，具體步驟同試劑盒說明書。利用紫外分光光度儀測定RNA的OD260/OD280值，確保比值在1.8～2.0，應用逆轉錄試劑盒將總RNA逆轉錄成cDNA；以GAPDH為內參，按熒光定量試劑盒說明步驟建立PCR反應體系。反應體系：2×SYBR Mix 10 μL,10×cDNA模板1 μL,上下游引物各0.5 μL。引物序列：Ptch1上游5′-CAGAGAAGGCTTGTGGCCAC-3′、下游5′-GCTCAATGACTTCCACCTTCG-3′，Gli2上游5′-TGGCCGCTTCAGATGACAGATGTTG-3′，下游5′-CGTTAGCCGAATGTCAGCCGTGAAG-3′，Cyclin D1上游5′-CCATGGAACACCAGCTCCTG-3′，下游5′-CGGTCCAGGTAGTTCATGGC-3′；反應條件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40個循環。實驗重復3次，以目的基因域循環數(Ct)值對同一樣本的內參照基因GAPDH Ct值進行目的基因表達的相對定量分析。

1.2.3 HepG2細胞中Gli2、Ptch1、Cyclin D1蛋白檢測 采用Western blotting法。取各組細胞于1.5 mL EP管中，在4 ℃高速離心機中以1 500 r/min離心5 min；棄除培養液并保留細胞沉淀，用預冷PBS洗3次；加入細胞裂解混合液(細胞裂解液1 000 μL、磷酸酶抑制劑10 μL、蛋白酶抑制劑 1 μL、PMSF 10 μL)，置于4 ℃搖床劇烈震蕩30 s，放置冰上裂解30 min。在4 ℃高速離心機中以12 000 r/min離心5 min，取上清全蛋白提取物，用BCA蛋白定量試劑盒測定各組樣本蛋白濃度。變性后取30 μg總蛋白，用10%分離膠進行SDS-PAGE電泳(濃縮膠45 V、分離膠55 V，4 h)。電泳完畢后，將蛋白用半干轉膜儀電轉至PVDF膜；根據Marker剪下相應區域的PVDF膜，用含5%脫脂奶粉的TBST封閉液封閉，室溫搖床孵育2 h；分別加用TBST稀釋1∶1 000的一抗，4 ℃冰箱孵育過夜；用TBST溶液充分洗滌PVDF膜3次，每次10 min。分別將PVDF膜置于1∶10 000稀釋的二抗封閉夜中，室溫搖床下孵育1 h；用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10 min。將PVDF膜在濾紙上控干后，用ECL顯色試劑盒顯色；在UPVINC凝膠成像系統顯影，掃描膠片并用Image J軟件測量各條帶灰度值。以β-Tubulin為內參，以目的蛋白與內參灰度比值表示目的蛋白相對表達量。

2 結果

2.1 兩組細胞中Gli2、Ptch1、Cyclin D1 mRNA表達比較 與對照組比較，實驗組細胞中Hedgehog信號通路Gli2、Ptch1、Cyclin D1 mRNA相對表達量均降低(P均<0.05)。見表1。

表1 兩組細胞中Gli2、Ptch1、Cyclin D1 mRNA表達比較

注：與對照組比較，*P<0.05。

2.2 兩組細胞中Gli2、Ptch1、Cyclin D1蛋白表達比較 與對照組比較，實驗組細胞中Hedgehog信號通路Gli2、Ptch1、Cyclin D1蛋白相對表達量均降低(P均<0.05)。見表2、圖1。

表2 兩組細胞中Gli2、Ptch1、Cyclin D1蛋白表達比較

注：與對照組比較，*P<0.05。

圖1 HepG2細胞中Gli2、Ptch1、Cyclin D1蛋白表達情況(Western blotting法)

3 討論

Hedgehog信號通路在正常胚胎和干細胞的發育中起著關鍵作用，而腫瘤的形成與該通路異常激活密切相關。大量實驗研究表明，Hedgehog信號在肝癌、基底細胞癌、髓母細胞瘤、白血病、胃癌、食管癌、結腸癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、乳腺癌和前列腺癌中激活[2]。有學者通過建立一種轉基因小鼠模型觀察Hedgehog表達與肝纖維化及腫瘤發生發展的關系，最終發現Hedgehog通路在肝臟中的表達引起肝纖維化，同時激活肝星狀細胞和成纖維基因，促進癌基因表達而誘發肝癌發生[3,4]。Hedgehog信號通路由配體(hh)、跨膜蛋白受體(Ptch1)、跨膜蛋白(Smo)及轉錄因子(Gli1、Gli2、Gli3)等組成。當前研究認為，Gli1是轉錄激活因子，Gli3是轉錄抑制因子，而Gli2是主要的調節轉錄激活物。當細胞膜上的Ptch1與hh配體結合時，Hedgehog通路啟動，從而激活Gli2轉錄因子，繼而調控靶基因Gli1、Bcl-2、c-Flip、Cyclin D1、c-myc及VEGF的表達，觸發腫瘤細胞增殖等。在細胞周期增殖過程中，Cyclin D1能加快細胞由G1期轉化到S期，使細胞周期加快，引起細胞過度增殖。典型的Hedgehog信號通過誘導Cyclin D1和c-myc基因在細胞增殖中起重要作用[5]，因此該通路被認為是肝癌治療的重要靶點。在肝癌細胞株及肝癌組織中,Hedgehog信號通路相關因子均高表達[6]。Yu等[7]發現，在接受5-氟尿嘧啶化療的胃癌患者中，Gli2高表達與癌癥復發的風險增加有關；下調Gli2表達后使胃癌細胞對化療藥物更加敏感，進而抑制胃癌細胞增殖。在調控靶基因表達和肝癌細胞增殖方面，Gli2在肝癌細胞增殖中起主導作用，下調Gli2表達后可明顯抑制腫瘤細胞增殖，表明抑制Gli2表達為肝癌的治療提供了新途徑[8]。

硼是人體一種重要的微量元素，在體內主要以硼酸鹽的形式發揮功能，參與人體生長發育、能量利用、骨質代謝、免疫調節等過程，具有特殊的生理作用。有文獻報道，硼的化合物可作為多種蛋白酶抑制劑，可發揮抗凝血、抗細菌、抗真菌、抗病毒、抗腫瘤、調節激素等作用[9]。以硼酸為結構的選擇性肽類化合物，作為蛋白酶抑制劑，對60種人腫瘤細胞株生長具有抑制作用[10]。在一項大鼠肝癌細胞實驗中發現，硼能夠部分逆轉肝細胞損傷，減少氧化應激及自由基的產生，進而負向調節肝癌細胞的分裂增殖[11]。在腫瘤治療方面，硼中子俘獲治療以其精準靶向、低毒高效的優勢成為新型放射治療方法，已經成功治愈了腦膠質瘤、復發性頭頸部腫瘤、黑色素瘤等疾病[12]。氮化硼納米球可以將抗癌藥物有效地輸送到腫瘤細胞中，從而使其成為治療癌癥的潛在靶向納米載體[13]。五水五硼酸二鈉對人前列腺癌細胞株DU145的生長具有明顯抑制作用，其可能是通過干擾肌動蛋白聚合的動態特性和降低端粒酶活性而發揮其細胞生長抑制作用[14]。p53是重要的腫瘤抑制基因，硼酸鈉可以活化HepG2細胞p53基因的表達，激活并上調Bax基因表達水平，抑制Bcl-2基因表達，從而啟動線粒體依賴的凋亡途徑，誘導HepG2細胞凋亡[15]。另一項研究發現，硼酸鈉作用于HepG2細胞后通過上調促凋亡蛋白CHOP的表達并活化內質網應激蛋白Grp78，從而誘導細胞發生凋亡[16]。

結合課題組前期研究成果，我們發現硼酸鈉對HepG2細胞生長活性具有明顯抑制作用，Hedgehog信號通路與肝癌細胞增殖密切相關。為了進一步研究硼酸鈉抑制HepG2細胞生長機制與Hedgehog信號通路之間的關系，我們檢測了HepG2細胞中Hedgehog信號通路中相關因子的表達情況。結果發現，實驗組細胞中Hedgehog信號通路關鍵因子Gli2、Ptch1、Cyclin D1 mRNA及蛋白的表達量較對照組降低。這表明硼酸鈉作用于HepG2細胞后可明顯抑制Hedgehog信號通路表達，該通路中主要轉錄激活物Gli2因子表達明顯降低，通路下游細胞周期蛋白Cyclin D1表達下降，從而抑制了腫瘤細胞周期中由G1期到S期的轉化過程，并最終抑制腫瘤細胞增殖。通過本次研究，我們認識到硼酸鈉可通過下調Hedgehog信號通路的表達進而抑制HepG2細胞增殖，這進一步表明硼酸鈉在細胞信號傳導中具有抗腫瘤的效應，為新型抗腫瘤藥物的研發及作用靶點提供了有利支撐。