miR-150在肺癌細胞中表達變化及其對細胞增殖能力的影響和機制

張靖雯，孫亞嬌，王東，陳復輝

(哈爾濱醫科大學附屬第二醫院，哈爾濱150086)

肺癌是最常見的惡性腫瘤，在全球癌癥相關死因中位居第一[1]。目前，雖然許多分子靶點已經確定可以改善肺癌的治療療效，但患者5年總生存率仍約為16%[2]。因此，進一步尋找肺癌發生發展新的分子機制，對肺癌患者的治療及生存質量提高具有重要意義。微小RNA(miRNA)是一類由19～25個核苷酸構成的小分子非編碼單鏈RNA，其通過結合靶基因mRNA的3′非翻譯區，調控基因轉錄后表達水平[3]，在腫瘤細胞增殖、凋亡及其他生物過程中起關鍵作用[4]。研究報道，miR-150在肺癌組織中高表達，且高表達患者預后較差[5]，并可以通過調控上皮間質轉化(EMT)促進肺癌的侵襲和轉移[6]，但其在肺癌增殖中的作用及機制尚未明確。2017年1月～2018年10月，我們以肺癌細胞株A549為研究對象，觀察miR-150在肺癌細胞增殖中的作用，為開發肺癌基因治療新靶標提供實驗數據。

1 材料與方法

1.1 主要材料 人肺癌細胞A549、人肺正常上皮細胞16HBE均購自美國ATCC細胞庫，DMEM-F12培養基、RPMI1640培養基、胎牛血清(FBS)購自美國Gibco公司；MTS細胞增殖及細胞周期檢測試劑盒、蛋白裂解試劑均購自南京凱基生物技術有限公司，逆轉錄試劑盒、SYBR實時熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)試劑盒等均購自日本TaKaRa公司。miR-150抑制物、miR-150模擬物(mimics)、內參GAPDH和c-Myc、Cyclin D1的引物由上海捷瑞生物工程有限公司設計合成，脂質體2000、TRIzol均購自美國Invitrogen公司；兔抗人c-Myc抗體(ab39688)、兔抗人Cyclin D1抗體(ab134175)、鼠抗人GAPDH抗體(ab8245)及BCA試劑盒購自美國Thermo公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養與分組轉染 將細胞培養在37 ℃、5% CO2全濕度培養箱中，A549細胞培養基為含10% FBS的DMEM-F12，16HBE細胞培養基為含10% FBS的RPMI1640。A549細胞細胞呈對數生長期時，將細胞鋪至6孔板；貼壁24 h后將細胞分為抑表達組、促表達組和對照組，抑表達組、促表達組按說明書將脂質體2000分別與miR-150抑制物、miR-150 mimics轉染至細胞，對照組不轉染，置于培養箱中培養48 h。

1.2.2 miR-150表達檢測 采用qRT-PCR法。設計miR150引物上游為5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTA-3′、下游為5′-TTCGCA GATACGACCACTGG-3′，GAPDH引物上游為5′-ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3′、下游為5′-GCCATCACGCCACAGTTTC-3′。取A549、16HBE細胞及各組轉染細胞，采用TRIzol法裂解細胞提取總RNA。將RNA逆轉錄成cDNA，以GAPDH為內參基因進行熒光定量PCR。每個樣品設置3個反應復孔，按兩步法進行反應，分析各樣品的循環閾值(Ct)，用2-ΔΔCt法分析miR-150相對表達量。重復實驗3次。

1.2.3 A549細胞增殖能力觀察 采用MTS法。取各組細胞，以2×103/孔、150 μL培養基接種于96孔板，每組設6個平行復孔，置于培養箱中培養；分別在鋪板后24、48、72 h時，各孔加入MTS工作液30 μL；培養箱中孵育2 h后，掃描酶標儀490 nm波長處測取光密度(OD)值。OD值越高提示存活細胞數越多，細胞相對增殖能力越強。重復實驗3次。

1.2.4 A549細胞克隆形成能力觀察 采用平板克隆形成實驗。取各組細胞，以3×102/孔、2 mL培養基接種于6孔板，每組設3個平行復孔，置于培養箱中培養；培養1周時，各組轉染試劑重復加入各組孔中1次，繼續培養1周；棄掉培養基，PBS洗3次，加1 mL甲醇固定15 min；晾干后加入1 mL蘇木素染色30 min，雙蒸水沖洗后晾干；掃描拍照，計數肉眼可見克隆團。重復實驗3次。

1.2.5 A549細胞周期檢測 采用流式細胞術。取各組細胞，以1×106/管接種3管；PBS洗3次后，以預冷的70%乙醇固定24 h；PBS洗2次后，加入500 μL的PI染色工作液(12.5 μL的PI儲存液，5 μL的RNase儲存液)，混勻后37 ℃溫箱中避光孵育30 min。PBS洗1次后，上流式細胞儀檢測各周期細胞比例。重復實驗3次。

1.2.6 A549細胞中c-Myc、Cyclin D1 mRNA檢測 采用qRT-PCR法。設計c-Myc引物上游為5′-TCCCTCCACTCGGAAGGAC-3′、下游為5′-CTGGTGCATTTTCGGTTGTTG-3′，Cyclin D1引物上游為5′-TGGAGCCCGTGAAAAAGAGC-3′、下游為5′-TCTCCTTCATCTTAGAGGCCAC-3′。取各組細胞，qRT-PCR法同1.2.2，按說明書操作，用2-ΔΔCt法分析c-Myc、Cyclin D1 mRNA相對表達量。重復實驗3次。

1.2.7 A549細胞中c-Myc、Cyclin D1蛋白檢測 采用Western blotting法。取各組細胞，加入500 μL/孔的蛋白裂解液(含5 μL的蛋白酶抑制劑和5 μL的磷酸酶抑制劑)，超聲裂解30 min；4 ℃下以12 000 r/min離心30 min，將上清轉移至新的EP管中，BCA試劑盒測蛋白濃度；煮沸變性后，每孔加50 μg蛋白行SDS-PAGE電泳；經濕轉將蛋白轉移至PVDF膜，8%脫脂牛奶封閉3 h；加入GAPDH、c-Myc、Cyclin D1一抗，4 ℃孵育過夜；TBST洗3次后，加入二抗孵育室溫孵育2 h；ECL化學發光法曝光條帶，掃描拍照。采用Quantity One V4軟件分析蛋白條帶灰度值，以目的蛋白與內參GAPDH蛋白條帶灰度比值表示目的蛋白表達量。重復實驗3次。

2 結果

2.1 A549、16HBE細胞miR-150表達比較 A549細胞中miR-150相對表達量為10.21±0.06，高于16HBE細胞的1.00±0.10(P<0.05)。

2.2 A549細胞轉染后miR-150表達比較 抑表達組、促表達組和對照組miR-150相對表達量分別為0.18±0.09、9.43±0.24、1.00±0.10，miR-150相對表達量促表達組>對照組>抑表達組(P均<0.05)。說明miR-150抑制物和模擬物作用較強，可繼續后續的功能實驗。

2.3 各組A549細胞增殖能力比較 見表1。

表1 各組A549細胞增殖OD490值比較

注：與對照組比較，*P<0.05，#P<0.01。

2.4 各組A549細胞克隆形成能力比較 抑表達組、促表達組合對照組細胞克隆形成數目分別為(60.68±9.49)、(286.58±15.90)(167.15±11.37)個，細胞克隆形成數目促表達組>對照組>抑表達組(P均<0.05)。

2.5 各組A549細胞周期比較 見表2。

表2 各組A549細胞各周期細胞比例比較

注：與對照組比較，#P<0.05。

2.6 各組A549細胞中c-Myc、Cyclin D1 mRNA及蛋白表達比較 見表3。

表3 各組A549細胞中c-Myc、Cyclin D1 mRNA及蛋白表達比較

3 討論

隨著醫學技術的不斷進步，雖然人們在蛋白及基因分子水平對肺癌的發病機制有了新的認識，以及肺癌的手術、放化療及靶向藥物等聯合治療的應用，但肺癌的早期診斷率和預后并沒有好轉的趨勢[7，8]。目前，肺癌的發病機制尚未完全明確。因此，研究新的候選癌基因有望成為提高肺癌診斷及改善預后的關鍵。miRNA作為高度保守的一類小分子非編碼單鏈RNA，在多種信號通路中發揮重要作用[9，10]。研究發現，miRNA在多種腫瘤組織中表達異常，可作為腫瘤診斷的早期指標，并且與患者的預后密切相關；因其具備癌基因和抑癌基因的作用，還可作為腫瘤治療的潛在靶點[11，12]。

miR-150因在正常造血作用中具有重要的調節作用而被較早鑒定出來[13]。Dezhong等[14]在前列腺癌組織中觀察到miR-150表達上調，并與腫瘤的復發轉移呈正相關；周毅波等[15]研究發現，miR-150可通過上調其靶基因Nanog促進鼻咽癌細胞的增殖與侵襲。而最近研究也發現，miR-150高表達與非小細胞肺癌的侵襲和遷移有關[16]，但miR-150高表達與肺癌增殖的關系尚不清楚。本研究發現，miR-150在A549中表達高于16HBE,采用miR-150抑制物和mimics轉染A549細胞進一步研究miR-150在肺癌細胞中發揮的作用;轉染miR-150抑制物后細胞中miR-150表達降低，功能實驗顯示細胞增殖能力和平板克隆形成能力下降；轉染miR-150 mimics后細胞中miR-150表達增多，功能實驗顯示細胞增殖能力和平板克隆形成能力增強。上述結果提示，高表達miR-150可促進肺癌細胞增殖。

腫瘤為一類細胞周期紊亂性疾病，大部分癌基因與抑癌基因發揮作用的最終效應都會匯集到細胞周期，而細胞周期不受控制將導致細胞異常增殖而促進腫瘤的發生[17]。因此，為了深入研究miR-150促進肺癌細胞增殖的作用機制，我們進一步采用流式細胞儀檢測細胞轉染miR-150抑制物和mimics后細胞周期的變化；結果顯示，轉染miR-150抑制物后G1期細胞比例增多，表明細胞周期明顯阻滯在G1期；轉染miR-150 mimics后G2期細胞比例增多，表明細胞周期明顯阻滯在G2期。這提示細胞中miR-150表達減少，使細胞阻滯在G1期而不能進入到S期、G2期以及細胞有絲分裂期，成功地抑制了細胞增殖；而細胞中miR-150表達增多，使細胞阻滯在G2期而不能進入到細胞有絲分裂期，抑制了細胞增殖，與本研究miR-150表達增多促進細胞增殖現象是相矛盾的。研究發現，G2細胞周期的停滯可能存在腫瘤發展的早期階段，G2期細胞增多是由于c-Myc基因表達增多，導致G2期阻滯的細胞變成非整倍體，即核內復制[18]。因此，考慮miR-510增多導致的G2期細胞增多可能是c-Myc基因的表達增多引起的，最終導致的結果是促進細胞增殖。

c-Myc是調節細胞增殖、遷移和血管生成的癌基因[19]，可作為轉錄因子異位至細胞核發揮作用；其靶基因較多，而與細胞周期有關的細胞周期蛋白Cyclin D1即為其中之一。本研究結果顯示，與對照組比較，抑表達組c-Myc、Cyclin D1 mRNA及蛋白相對表達量下降，促表達組c-Myc、Cyclin D1 mRNA及蛋白增加。這提示細胞中c-Myc和Cyclin D1表達水平與miR-150表達水平一致，表明miR-150可能通過促進c-Myc和其靶基因Cyclin D1的表達促進肺癌細胞的增殖。

綜上所述，肺癌A549細胞miR-150表達增加；miR-150可能通過上調c-Myc、Cyclin D1表達促進細胞周期的進程，進而增強肺癌細胞的增殖能力。因此，miR-150是肺癌A549細胞活化增殖潛在的靶向分子，可為干預和預防肺癌提供實驗室數據和新的思路。