Mmu-miR-124靶基因預測及通過GSK3B調控神經發育的可能性：基于生物信息學和qPT-PCR分析

蔣云鳳 孫宇

哺乳動物中樞神經系統的發育是一個貫穿始終的復雜過程。異常的神經發育可能會導致終身殘疾甚至死亡[1-2]。在神經發生過程中，神經干細胞有可能產生三種細胞亞系，包括星形膠質細胞、少突膠質細胞和神經元[3-4]。神經元是一類由胞體、軸突和樹突組成的雙極性細胞，神經元軸突的發育過程包括極性的建立、軸突導向和軸突的延伸分支，這些發育過程對于神經元的發育以及腦建立神經環路至關重要[5]。軸突導向在發育過程中引導軸突生長[6]，并控制成年突觸連接的結構可塑性。因此，進一步探究軸突導向的失調如何導致疾病發生，以及其分子機制，將有助于神經類疾病治療策略的進一步發展。

核微小RNA（microRNA/miRNA）是一類長約18～23 核苷酸的非編碼小RNA，對靶基因進行轉錄后水平及翻譯水平調控，能特異性介導靶mRNA 降解或者抑制靶蛋白的翻譯[7]。大量文獻表明，miRNA參與多種生物學功能，如細胞分化、增殖、凋亡、遷移和轉移，調控多種疾病。因此，實現miRNA 藥物的安全靶治療具有很大的價值和前景[8-9]。Mmu-miR-124是已知大腦中表達最豐富和最具特征的miRNA。相關研究表明，miR-124 通過靶基因參與神經發生和神經元分化過程[10-12]；miR-124/PTPN1 信號通路參與老年性癡呆的突觸和記憶缺陷[13]；miR-124 也是中樞神經系統疾病（如神經膠質瘤、腦卒中等）有價值的診斷和預后指標[14-15]。因此，研究Mmu-miR-124 的靶基因及其在神經系統發育中軸突導向的相關信號通路具有很大的應用價值。

本研究通過生物學分析，預測Mmu-miR-124的靶基因，并對其靶基因集合進行Gene Ontology（GO）、Kyoto Encyclopediaof Genes and Genomes（KEGG）、Reactome Pathway 以及Protein-protein interaction（PPI）神經網絡分析，為尋找Mmu-miR-124在神經發育中靶基因的功能研究提供理論基礎，并通過qRT-PCR 初步驗證生物學分析的結果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

清潔級E14.5 C57 小鼠（共2 只）購買自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司，實驗動物生產許可為SCXK（滬）2018-0006。本實驗符合實驗動物倫理操作規范，上海交通大學附屬第九人民醫院實驗動物使用許可為SYXK（滬）2016-0016。

1.1.2 主要試劑和器材

DMEM/F12 培養基、B27 無血清補充劑、N_2 supplement、bFGF、EGF、多聚賴氨酸P6407-5MG、0.25%胰酶、Trizol（Invitrogen，美國）；Prime-Script RT 試劑（Takara 公司，）。

超凈工作臺、細胞培養箱（Thermo Fisher，美國），多功能酶標儀（Bio Tek，美國），倒置相差顯微鏡（Nikon，日本），實時熒光定量PCR 儀QuantStudio（ABI，美國）。

1.2 生物信息分析

1.2.1 Mmu-miR-124 的堿基序列

運用UCSC 基因組在線瀏覽工具（http://genome.ucsc.edu/）分析Mmu-miR-124 在基因組中的位置及保守性。運用mirbase（http://mirbase.org/index.shtml）查詢Mmu-miR-124 的堿基序列。

1.2.2 預測可能的靶點基因

目標基因的選擇對于表征miRNA 的功能至關重要。本研究使用StarBase（http://starbase.sysu.edu.cn）數據庫預測Mmu-miR-124 的靶基因，選擇mi-Randa（http://www.microrna.org/）、TargetScan（http://www.targetscan.org/）、microT、miRmap、PITA、RNA22、PicTar 中至少4 個軟件重合預測的基因，納入最后的統計。

1.2.3 基因本體論和通路富集分析

基于至少3 個數據庫獲得靶點基因后，通過DAVID（https://david.ncifcrf.gov/）在線工具進行GO分析，識別靶點基因的功能類別，包括生物過程（BP）、分子功能（MF）和細胞成分（CC）。同時，進行KEGG pathway 富集分析，分析這些靶基因可能富集的信號通路。

1.2.4 整合蛋白-蛋白相互作用（PPI）網絡構建

交互基因檢索工具（STRING）數據庫是一種在線的蛋白質交互（PPI）信息評價工具。為了評估靶點基因之間的交互關系，點基因被上傳到STRING（版本10.5；http://www.string-db.org/），然后利用Cytoscape 軟件構建PPI 調控網絡。通過其插件MCODE 對蛋白網絡進行分析，根據蛋白之間相互作用程度（Degree）篩選出最有意義的30 個樞紐基因（hub gene）。此外，通過與KEGG 通路中的軸突導向通路的主要基因進行重合，以獲得關鍵基因。

1.3 實時熒光定量PCR 分析

1.3.1 神經干細胞的培養

將E14.5 C57 小鼠胎鼠腦組織取出，加入0.25%胰酶，在培養箱中消化18 min。加入10 mL 含10%FBS 的接種培養基終止消化。過尼龍網去除組織碎片。將上清置于離心機中，1 500 r/min 轉速離心5 min，棄上清，用含有1%N2 的DMEM/F12 重懸。將細胞以0.1×106cells/mL 的密度接種于多聚賴氨酸（Poly-D-lysine，PDL）（50 μg/mL）包被的培養板中，每2～3 天加液一次。神經干細胞分化培養基中含有20 ng/mL 的bFGF、EGF 和2%B27。置于37 ℃培養箱中培養，培養過程中使用倒置相差顯微鏡觀察神經干細胞的生長情況。

1.3.2 qRT-PCR

按照說明書分別于第3、5、7、10 天提取神經干細胞的總RNA。逆轉錄使用Prime-Script RT 試劑逆轉錄重組特定的cDNA；反轉錄條件：37 ℃15 min，85 ℃5 sec。每個目標基因的表達水平檢測使用一個標準的SYBR-Green 方法，以cDNA 為模板，擴增條件：預變性95 ℃30 sec；變性95 ℃5 sec；退火60 ℃30 sec，延伸72 ℃30 sec，重復40 個循環。以GAPDH 為內參基因，使用2-ΔΔCt法計算目標基因的相對表達水平（表1）。

表1 熒光定量PCR 引物序列Table 1 Realtime-PCR primer sequences

2 結果

2.1 Mmu-miR-124 的位置

首次在小鼠身上發現的成熟Mmu-miR-124，在小、大鼠和人類中完全同源。通過UCSC 基因組在線瀏覽工具得到Mmu-miR-124 在基因組中的位置（圖1）。

圖1 Mmu-miR-124 在基因組中所處的位置Fig.1 The location of Mmu-miR-124 in the genome

2.2 Mmu-miR-124 的靶基因預測

運用StarBase（http://starbase.sysu.edu.cn）數據庫預測Mmu-miR-124 的靶基因，并選擇miRanda（http://www.microrna.org/）、TargetScan（http://www.targetscan.org/）、microT、miRmap、PITA、RNA22、PicTar中至少4 個軟件重合預測的基因，最終共納入775個基因進入統計。

2.2.1 Mmu-miR-124 靶基因的GO 分析

將數據庫預測的775 個靶基因上傳至DAVID網站進行GO 功能分析，并列舉出生物過程（BP）、分子功能（MF）和細胞成分（CC）的前5 個重要通路。GO 結果表明，Mmu-miR-124 靶基因在生物功能方面主要與內吞作用、翻譯負調節和細胞形狀調節有關；在分子功能方面主要與磷脂酰肌醇綁定、轉錄激活子活性、RNA 聚合酶II 核心啟動子近端區序列特異性結合和mRNA 3'-UTR 綁定有關；在細胞成分方面主要與皺褶、核膜和刷毛緣有關（表2）。

2.2.2 Mmu-miR-124 靶基因的Reactome 通路分析

將數據庫預測的775 個靶基因上傳至Reactome pathway Database（https://www.reactome.org/），Reactome 通路分析，結果顯示：靶點基因通路主要富集于RNA 聚合酶iii 轉錄終止、FGFR2 信號通路和IRS 介導的信號通路（圖2）。

2.2.3 Mmu-miR-124 靶基因的KEGG 通路分析

將775 個靶基因上傳至DAVID（https://david.ncifcrf.gov/）網站行KEGG 分析，結果顯示：通路主要富集于軸突導向、長時程壓抑和鞘脂類代謝（表3）。

2.2.4 Mmu-miR-124 靶基因蛋白間的相互作用預測

通過字符串將預測的靶點基因上傳至網絡進行PPI 分析，并篩選出前30 個樞紐基因與KEGG 通路中的軸突導向通路的主要基因進行重合并得到關鍵基因：GSK3B、NRAS 和ITGB1。

2.3 熒光定量實時PCR 結果

在神經干細胞的培養過程中，倒置顯微鏡觀察神經干細胞的生長，分別于第3、5、7、10 天提取神經干細胞的RNA，通過qRT-PCR 檢測發現，ITGB1 不存在，隨時間延長，Mmu-miR-124 表達增加，GSK3B表達略下降，NRAS 表達不變。Mmu-miR-124 與GSK3B 的堿基互補配對序列的配對預測提示了兩者之間可能存在緊密的聯系（圖3、4）。

表2 生物過程、分子功能和細胞成分的前5 個重要的GO 通路Table 2 Top 5 significant GO terms of BP,MF and CC

圖2 靶點基因的Reactome 通路Fig.2 Reactome pathway of target genes

表3 前10 個關鍵的KEGG 通路Table 3 Top 10 significant Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes pathways

圖3 在神經發育中mmu-miR-124 及其靶基因的表達變化Fig.3 Changes in the relative expression of mmu-miR-124 and its target genes during the neurodevelopment

圖4 Mmu-miR-124 與GSK3B 的堿基配對預測Fig.4 Prediction of base pairing between mmu-miR-124 and GSK3B

3 討論

Mmu-miR-124 是大腦中表達豐富和功能強大的特異性microRNA，其通過多種機制參與神經系統疾病的發生，也是神經系統疾病診斷和治療的重要指標之一[14，16－17]。本研究通過預測Mmu-miR-124 的靶基因，并通過生物信息學的手段對其靶基因進行KEGG 通路分析，得到前10 個關鍵的KEGG 通路，其中，前兩個是與神經發育相關的通路：Axon guidance 和Long-term depression 通路，并將Axon guidance 通路中的14 個關鍵基因與PPI 蛋白網絡的前30 個Hub 基因取交集得到重合的3 個關鍵基因，并對關鍵基因進行初步的qRT-PCR 驗證。

許多神經疾病的特征是神經元連接的結構改變，從一開始的突觸變化到整個軸突束的丟失以及重新連接。這種擾亂連接結構過程的分子機制尚不明確，然而，最新的研究結果表明，軸突導向蛋白在連接結構紊亂中發揮了重要的作用[6，18－19]。軸突導向蛋白在神經發育過程中引導軸突生長，并控制著成熟的突觸連接以及結構的可塑性。研究證明，MmumiR-124 參與神經發育的多個過程。本研究通過對Mmu-miR-124 的靶基因進行生物信息學分析發現，其可能在軸突導向通路中起到關鍵的作用。通過生物信息學預測，并對所得的關鍵基因進行qRT-PCR初步驗證，我們認為Mmu-miR-124 可能通過絲氨酸/蘇氨酸激酶糖原合酶激酶-3（GSK3B）調控神經發育。研究表明，GSK3B 是多種細胞通路的主調控因子，包括胰島素信號和糖原合成、神經營養因子信號、Wnt 信號、神經遞質信號和微管動力學[20]。同時，GSK3B 與多種人類疾病有關，包括老年癡呆癥、雙相情感障礙、非胰島素依賴型糖尿病、心臟肥大和癌癥[21-23]。因此，Mmu-miR-124 很可能通過對靶基因GSK3B 的調控影響神經發育。

最近的研究證實，Mmu-miR-124 在神經系統以及腫瘤疾病中具有重要的生物學功能[13，16－17]，對Mmu-miR-124 靶基因功能的認識還有待進一步的探索和研究。本研究采用靶基因預測數據庫得到可信度較高的靶基因集合，并對靶基因進行GO 功能注釋和KEGG 信號轉導通路富集分析，有助于對Mmu-miR-124 所參與的生物學過程有一個較全面的認識，為進一步深入研究其功能奠定了基礎。但由于預測靶基因過程中不可避免地存在假陽性率，所以對預測得到的靶基因及其發揮的生物學功能需要進行進一步的實驗驗證。