電轉(zhuǎn)方法用于modRNA轉(zhuǎn)染細胞的初步研究

陳茂林 王會景 艾雪峰 顏冰倩 宮藝奇 譚瑤 付煒 王偉

中心法則是現(xiàn)代生物學的基礎，DNA 和RNA均可作為遺傳物質(zhì)，均可指導蛋白質(zhì)的合成。目前的研究多集中于DNA，而mRNA 相較于DNA 有以下優(yōu)勢：①mRNA 具有脈沖式表達的特性；②mRNA 安全性高，因其無需整合到宿主基因組中，故可排除插入誘變的風險[1-2]；③mRNA 具有快速表達的特性[3]，相較于DNA，mRNA 省略了轉(zhuǎn)錄步驟，因此可以更快地合成蛋白質(zhì)。

自1961 年發(fā)現(xiàn)mRNA[4]至1992 年AVP mRNA[5]用于治療大鼠尿崩癥，關(guān)于mRNA 的應用十分有限。這是由于mRNA 自身存在兩個限制因素：①不穩(wěn)定性和翻譯效率低。mRNA 在生理條件下不穩(wěn)定，易被細胞和細胞外核糖核酸酶（RNase）迅速降解，從而導致翻譯效率低下；②免疫原性高，mRNA 具有高度的免疫原性，進入細胞后可激活細胞Toll 樣受體（TLRs）導致炎癥和抑制蛋白質(zhì)翻譯[6-9]。直到2005年，Karik'o 等通過在體外化學修飾mRNA 的核苷酸，產(chǎn)生了更穩(wěn)定及更小免疫原性的modRNA[10-12]，從而解決了mRNA 作為表達載體易被降解和高度免疫原性的問題，開啟了modRNA 應用的大門。modRNA（Modified messenger ribonucleic acid，合成修飾的信使核糖核酸）是一項在體外對mRNA 的核苷酸進行化學修飾，以逃避機體固有免疫并表達目標蛋白的技術(shù)。2011 年有文獻報道m(xù)odRNA 在體內(nèi)成功表達目標蛋白[13]，并有報道利用modRNA 技術(shù)研發(fā)出對抗寨卡病毒的疫苗。此外，modRNA 目前已被應用于心、肝、胰、肺等器官的修復治療和去分化誘導產(chǎn)生iPS 細胞[14-18]。

目前，modRNA 應用主要為體內(nèi)轉(zhuǎn)染，而體內(nèi)轉(zhuǎn)染具有兩個局限性：①轉(zhuǎn)染試劑多為脂質(zhì)體，有一定的生物毒性；②體內(nèi)轉(zhuǎn)染效率低下導致表達效率受限[19]。鑒于體內(nèi)轉(zhuǎn)染的缺點，本研究設想在體外利用modRNA 轉(zhuǎn)染細胞，再結(jié)合細胞治療的方法，將修飾過的細胞重新輸回體內(nèi)。電轉(zhuǎn)染是通過高強度的電場作用，瞬時提高細胞膜的通透性，從而吸收周圍介質(zhì)中的外源分子。電轉(zhuǎn)法操作簡單，可重復性高，無毒，對于各種類型細胞均可轉(zhuǎn)染，但對于不同種類的細胞，電轉(zhuǎn)染參數(shù)各不相同，包括電壓、脈沖時間、溫度、細胞狀態(tài)和數(shù)量等均會影響電轉(zhuǎn)染的效率[20]。故本研究擬探討電轉(zhuǎn)方法用于modRNA 轉(zhuǎn)染細胞的可行性，并篩選出人成纖維細胞、Hela 細胞、293T 細胞和3T3 細胞電轉(zhuǎn)所需的最適電壓和脈沖時間。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與材料

人成纖維細胞來源于兒童包皮環(huán)切術(shù)后廢棄的包皮組織，由上海交通大學附屬上海兒童醫(yī)學中心泌尿外科提供，家長對治療及實驗均知情同意。本實驗經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準。

DMEM 高糖培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶、胎牛血清（Hyclone，美國）。

Leica 生物倒置顯微鏡DMI3000 B（成貫儀器有限公司）；BD FACS Canto Ⅱ流式細胞儀、Lonza 電轉(zhuǎn)儀（上海普迪生物技術(shù)有限公司）；Celetrix 電轉(zhuǎn)儀（深圳市達科為生物技術(shù)股份有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 modRNA 的設計、制備

參照文獻[21]查找到相應的EGFP（Enhanced green fluorescent protein，增強型綠色熒光蛋白）、nGFP（Nuclear GFP，核綠色熒光蛋白）、mCherry 的CDS（Codig sequence，編碼序列）序列；在CDS 序列前后添加5' 和3' 非翻譯區(qū)等序列，之后插入到PUC57 質(zhì)粒載體；將上述質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到DH5α 大腸桿菌中擴增；提取質(zhì)粒并使用限制性內(nèi)切酶將質(zhì)粒線性化，對所需片段進行PCR 擴增；PCR 的產(chǎn)物體外轉(zhuǎn)錄后純化并通過Nanodrop 和生物分析儀進行RNA 濃度和質(zhì)量控制。

1.2.2 人成纖維細胞的原代培養(yǎng)

收取包皮組織3～5 塊，超凈臺中用含5%青-鏈霉素的PBS 緩沖液沖洗3～5 遍。剪去除包皮皮下附著的脂肪、毛細血管等，將組織剪成2 mm×1 cm 的長條形組織塊，0.3%的中性蛋白酶浸沒，4 ℃冰箱過夜消化；次日取出，將包皮的表皮層用鑷子分離，只留下真皮組織，將其剪成約1 mm×1 mm×1 mm 大小，0.3%Ⅳ型膠原酶浸沒，37 ℃搖床200 r/min 消化2～3 h。待組織完全消化，用40 μm 孔徑的細胞濾網(wǎng)過濾，收集濾液，離心棄上清，PBS 重懸，離心再棄上清。加入2 mL 配制好的完全培養(yǎng)基（10%FBS+DMEM 高糖溶液+雙抗）制成細胞懸液，按每塊包皮2～3 個10 cm 皿的密度接種于配制好的完全培養(yǎng)基中，于37 ℃、5%CO2下培養(yǎng)，隔天換液，細胞融合達80%～90%時傳代，第2～4 代用于實驗。

1.2.3 人成纖維細胞電轉(zhuǎn)EGFP modRNA 條件篩選

每6×105個人成纖維細胞加入20 μL 電轉(zhuǎn)液和2 μg EGFP modRNA。取20 μL 混合液加入電轉(zhuǎn)杯中，保持脈沖時間30 ms 不變，分別于435 V、440 V、445 V 電壓下電轉(zhuǎn)，將電轉(zhuǎn)后的細胞轉(zhuǎn)入24 孔中，加入完全培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2下培養(yǎng)，24 h后熒光顯微鏡下觀察拍照，并通過流式檢測儀檢測EGFP 熒光強度和表達效率。SPSS 分析結(jié)果，確定最適電壓。保持電壓不變，分別于20 ms、30 ms、40 ms脈沖時間下電轉(zhuǎn)，將電轉(zhuǎn)后的細胞轉(zhuǎn)入24 孔中，加入完全培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2下培養(yǎng)，24 h 后熒光顯微鏡下觀察拍照，并通過流式檢測儀檢測EGFP熒光強度和表達效率。SPSS 分析結(jié)果，確定最適脈沖時間。

為了觀察EGFP 蛋白表達隨時間變化的關(guān)系，使用最適電壓和脈沖時間向人成纖維細胞電轉(zhuǎn)EGFP modRNA，連續(xù)7 d 進行熒光拍照及流式檢測。

1.2.4 人成纖維細胞電轉(zhuǎn)nGFP/EGFP+mCherry modRNA

每6×105個人成纖維細胞加入20 μL 電轉(zhuǎn)液和2μg nGFP modRNA；每6×105個人成纖維細胞加入1 μg EGFP、1 μg mCherry modRNA 和20 μL 電轉(zhuǎn)液；最適電壓和脈沖時間下電轉(zhuǎn)，將電轉(zhuǎn)后的細胞轉(zhuǎn)入24 孔中，加入完全培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2下培養(yǎng)，24 h 后熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.2.5 Hela/293T/3T3 細胞電轉(zhuǎn)EGFP modRNA 條件的篩選

對于Hela 細胞，保持脈沖時間30 ms 不變，分別在415 V、425 V、435 V 電壓下電轉(zhuǎn)，確定最適電壓后，保持最適電壓不變，分別于20 ms、30 ms、40 ms脈沖時間下電轉(zhuǎn)。293T 細胞保持脈沖時間30 ms 不變，分別于390 V、400 V、410 V 電壓下電轉(zhuǎn)，確定最適電壓后，保持最適電壓不變，分別于20 ms、30 ms、40 ms 脈沖時間下電轉(zhuǎn)。3T3 細胞保持脈沖時間30 ms 不變，分別于430 V、440 V、450 V 電壓下電轉(zhuǎn)，確定最適電壓后，保持最適電壓不變，在20 ms、30 ms、40 ms 脈沖時間下電轉(zhuǎn)。

1.2.6 統(tǒng)計學處理

每組實驗在相同情況下重復3 次，所得數(shù)據(jù)通過SPSS 20 軟件進行分析。數(shù)據(jù)以（）表示，采用t檢驗進行比較。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 人成纖維細胞電轉(zhuǎn)EGFP modRNA 條件篩選

為了篩選電轉(zhuǎn)EGFP modRNA 入人成纖維細胞最佳的電壓和脈沖時間參數(shù)，首先固定脈沖時間，使用不同電壓電轉(zhuǎn)；再固定電壓，使用不同脈沖時間電轉(zhuǎn)，電轉(zhuǎn)后24 h，通過對不同電轉(zhuǎn)參數(shù)的人成纖維細胞進行熒光拍照，肉眼觀察。結(jié)果顯示，使用不同電壓和脈沖時間電轉(zhuǎn)后，人成纖維細胞均有熒光蛋白表達（圖1A-F），但電壓440 V，脈沖時間30 ms時熒光強度最高（圖1B、E）。

流式結(jié)果顯示，2 μg EGFP modRNA 在不同電壓下轉(zhuǎn)染人成纖維細胞，435 V、30 ms 時轉(zhuǎn)染效率為93.7%±0.7%；440 V、30 ms 時轉(zhuǎn)染效率為97.3%±0.4%；445 V、30 ms 時轉(zhuǎn)染效率為94.6%±0.5%。三者差異顯著（P＜0.05），選擇440 V 作為最適電壓（圖2A-C）。

2 μg EGFP modRNA 選擇不同脈沖時間轉(zhuǎn)染人成纖維細胞，440 V、20 ms 時轉(zhuǎn)染效率為93.2%±3.2%；440 V、30 ms 時轉(zhuǎn)染效率為97.3%±0.4%；440 V、40 ms時轉(zhuǎn)染效率為81.1%±1.1%，三者差異顯著（P＜0.05）。選擇30 ms 作為最適脈沖時間（圖2D-F）。

2.2 EGFP modRNA 表達隨時間變化關(guān)系

為了觀察EGFP modRNA 表達隨時間的變化，使用最適電壓和脈沖時間向人成纖維細胞電轉(zhuǎn)EGFP modRNA 后，對人成纖維細胞進行連續(xù)7 d 的熒光拍照和流式分析。在440 V、30 ms 條件下電轉(zhuǎn)，連續(xù)7 d 熒光可觀察到熒光強度呈現(xiàn)脈沖式表達，自電轉(zhuǎn)后12 h 到電轉(zhuǎn)后2 d，熒光強度逐漸增強，電轉(zhuǎn)后2 d 熒光強度逐漸減弱。EGFP 表達高峰時間為電轉(zhuǎn)后24～48 h，持續(xù)時間約6 d（圖3）。

連續(xù)7 天流式檢測表明：前六天EGFP 表達效率基本持續(xù)在90%以上（圖4A-G、I），電轉(zhuǎn)后3 天效率最高，為（99±0.17）%（圖4D）；EGFP modRNA的表達呈現(xiàn)為脈沖式，EGFP 熒光強度高峰時間為電轉(zhuǎn)后24～48 小時,電轉(zhuǎn)后1 天和電轉(zhuǎn)后2 天熒光強度分別為6860.3±1264.6 和5896.7±163.8（圖4J）。

2.3 人成纖維細胞電轉(zhuǎn)nGFP/EGFP+mCherry modRNA

nGFP 與EGFP 作用場所不同，EGFP 在細胞質(zhì)中發(fā)揮作用，而nGFP 具有核定位序列，特異性進入核內(nèi)表達。在細胞實驗中，許多轉(zhuǎn)錄因子需進入核內(nèi)發(fā)揮作用，若nGFP 可進入核內(nèi)表達，則許多在核內(nèi)發(fā)揮作用的轉(zhuǎn)錄因子也可制作成modRNA 形式。在440 V、30 ms 條件下電轉(zhuǎn)nGFP modRNA 入人成纖維細胞，24 h 后熒光顯微鏡下可見細胞呈長梭形貼壁生長（圖5A），熒光下細胞核發(fā)出綠色熒光，熒光圖與DAPI 圖高度重疊（圖5B-D），說明nGFP 可高效進入人成纖維細胞核內(nèi)表達。

許多基因的調(diào)控或者疾病的治療需要多因子的協(xié)同作用。因此，本研究嘗試對一種細胞轉(zhuǎn)染兩種modRNA，評價電轉(zhuǎn)法的轉(zhuǎn)染效果，觀察單個細胞是否可電轉(zhuǎn)入兩種modRNA 并同時表達。440 V、30 ms條件下向人成纖維細胞電轉(zhuǎn)1 μg EGFP+1 μg mCherry modRNA，24 h 后熒光顯微鏡下可見人成纖維細胞發(fā)出綠色熒光和紅色熒光（圖6A、B），且紅色熒光和綠色熒光高度重合，紅/綠熒光與DAPI 大部分重合（圖6C、D），說明EGFP 和mCherry 可共存于同一細胞內(nèi)并同時表達。

2.4 Hela 細胞、293T 細胞和3T3 細胞電轉(zhuǎn)EGFP modRNA 條件的篩選

為了驗證電轉(zhuǎn)法對于不同貼壁細胞導入mod-RNA 的效果，使用Hela 細胞、293T 細胞和3T3 細胞導入EGFP modRNA，篩選最適電壓和脈沖時間的方法同前。在電壓425 V、脈沖時間30 ms 的條件下，向Hela 細胞電轉(zhuǎn)2 μg EGFP modRNA，24 h 后對細胞進行染色和熒光拍照，可見細胞呈不規(guī)則梭形貼壁生長，熒光下可見細胞發(fā)出綠色熒光，熒光圖與DAPI 圖高度重疊（圖7A-C），說明EGFP 可在Hela 細胞中高效表達。流式檢測EGFP 表達效率高達90.8%（圖7D）。

在電壓400 V、脈沖時間30 ms 條件下，向293T細胞電轉(zhuǎn)2 μg EGFP modRNA，24 h 后進行細胞染色和熒光拍照，可見細胞呈梭形貼壁生長，熒光下細胞發(fā)出綠色熒光，熒光圖與DAPI 圖高度重疊（圖8A-C），說明EGFP 可在293T 細胞中高效表達。流式檢測EGFP 表達效率高達90.4%（圖8D）。

在電壓440 V、脈沖時間30 ms 條件下，向3T3細胞電轉(zhuǎn)2 μg EGFP modRNA，24 h 后進行細胞染色和熒光拍照，可見細胞呈梭形貼壁生長，熒光下細胞發(fā)出綠色熒光，熒光圖與DAPI 圖高度重疊（圖9A-C），說明EGFP 可在3T3 細胞中高效表達。流式檢測EGFP 表達效率高達96%（圖9D）。

圖1 不同參數(shù)電轉(zhuǎn)EGFP modRNA 后熒光強度Fig.1 Fluorescence intensity after electrotransfer of EGFP modRNA with different parameters

圖2 不同參數(shù)電轉(zhuǎn)EGFP modRNA 后表達效率Fig.2 Expression efficiency after electrotransfer of EGFP modRNA with different parameter

圖3 不同時間EGFP modRNA 的表達Fig.3 Expression of EGFP modRNA at different times

圖4 流式檢測表達效率和熒光強度Fig.4 Detection of expression efficiency and fluorescence intensity by flow cytometry

圖5 電轉(zhuǎn)nGFP modRNA 后熒光圖Fig.5 Fluorescence diagram after electroporation of nGFP modRNA

圖6 電轉(zhuǎn)EGFP+mCherry modRNA 后熒光圖Fig.6 Fluorescence diagram after electroporation of EGFP+mCherry modRNA

圖7 Hela 細胞電轉(zhuǎn)EGFP modRNA 后熒光圖Fig.7 Fluorescence of Hela cells after electroporation with EGFP modRNA

圖8 293T 細胞電轉(zhuǎn)EGFP modRNA 后熒光圖Fig.8 Fluorescence of 293T cells after electroporation with EGFP modRNA

圖9 3T3 細胞電轉(zhuǎn)EGFP modRNA 后熒光圖Fig.9 Fluorescence of 3T3 cells after electroporation with EGFP modRNA

3 討論

modRNA 是一項新興技術(shù)，目前實驗中多為體內(nèi)注射[14，22]，轉(zhuǎn)染效率有限，故暫未獲得廣泛應用。本研究嘗試在體外利用modRNA 轉(zhuǎn)染細胞，再通過細胞治療的方法回輸細胞到體內(nèi)。貼壁細胞作為動物體內(nèi)最常見的細胞種類，取材方便，培養(yǎng)簡單，因此被作為實驗首選材料。目前導入外源性基因的方法主要有葡聚糖法、病毒法、基因槍、電轉(zhuǎn)染法等。某些真核動物細胞，如原代的T 細胞、神經(jīng)細胞和干細胞等，其特性決定了葡聚糖等化學試劑法轉(zhuǎn)染效果不佳。病毒轉(zhuǎn)染的繁瑣程序，并有潛在的危害性，因此無法大規(guī)模應用病毒來完成這些細胞的轉(zhuǎn)染實驗。基因槍法導入的基因往往是多拷貝隨機整合到受體基因組中，可能發(fā)生多種方式的重排。電轉(zhuǎn)染法又名電穿孔法，是通過高壓脈沖在細胞膜表面產(chǎn)生一個短暫的開放通道，從而吸收周圍介質(zhì)中的外源分子。該技術(shù)可將DNA、RNA、蛋白質(zhì)等導入各種類型細胞中[23-25]。由于電轉(zhuǎn)法操作簡單，可重復性高，無毒，對于各種類型細胞均可轉(zhuǎn)染，故本實驗使用電轉(zhuǎn)法嘗試將modRNA 導入貼壁細胞。

對于貼壁細胞，首先利用成纖維細胞轉(zhuǎn)染多種不同類型modRNA，轉(zhuǎn)染EGFP modRNA 是為了驗證modRNA 表達產(chǎn)物可在胞質(zhì)中表達；許多轉(zhuǎn)錄因子/蛋白需在細胞核內(nèi)發(fā)揮作用，由于nGFP 蛋白有一段核定位序列，需進入細胞核內(nèi)表達，因此轉(zhuǎn)染nGFP modRNA 是為了驗證modRNA 表達產(chǎn)物可進入胞核中表達；許多基因的調(diào)控或者疾病的治療需要多因子的協(xié)同作用，因此本研究嘗試對一種細胞進行兩種modRNA 的電轉(zhuǎn)，以觀察單個細胞是否可以電轉(zhuǎn)入兩種modRNA 并同時表達。最后利用同一類型modRNA 轉(zhuǎn)染三種不同貼壁細胞，證實modRNA 轉(zhuǎn)染的普遍性。

對于不同種類貼壁細胞，modRNA 電轉(zhuǎn)效率存在差別，目前暫無相關(guān)的原理解釋，但電轉(zhuǎn)不同種類貼壁細胞modRNA 的表達效率均在90%以上，已達到表達目的基因的要求。

未來的臨床應用中，modRNA 技術(shù)或可與細胞治療相結(jié)合，例如選取人皮膚成纖維細胞，體外擴增后作為modRNA 載體，體外導入目標modRNA 后，再局部注射到組織中，細胞即表達目標蛋白，從而達到治療的目的。