右歸丸對激素抵抗型腎病綜合征大鼠模型及SD蛋白的影響*

王新斌 薛國忠 陳威辛 戴恩來

激素抵抗型腎病綜合征是一種常見的多因素所致的病癥，作為腎病綜合征事件的高危因素，常易發展為終末期腎病而危及患者的生命[1]。近年來隨著基因診斷技術的突飛猛進，越來越多的研究表明SRNS本質是足細胞相關蛋白基因突變所致[2]。Nephrin、Podocin是近年發現的SD蛋白組分，已研究顯示其蛋白的表達或分布異常是蛋白尿形成機制中的關鍵因素[3,4]。中醫認為SRNS發病的主要原因是脾腎陽虛，依據 “益火之源，以消陰翳”理論，我們研究團隊前期采用右歸丸治療激素抵抗型腎病綜合征患者取得滿意的療效[5,6]。本研究通過復制非免疫因素介導的阿霉素所致激素抵抗型腎病綜合征，探討右歸丸在SRNS中的增敏作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物SPF級Wistar大鼠60只，雄性，體質量(180±20)g，由甘肅中醫藥大學科研實驗中心提供，動物合格證號：6200100000025，許可證號：SCXK(甘)2015-0002。動物飼養于SPF實驗中心，室溫22℃，輻照滅菌SPF級大鼠飼料喂養，給藥前禁食12 h，自由飲水。

1.2 藥物阿霉素(AD，Solarbio，批號111C024，規格:25 mg/支)；醋酸潑尼松片(浙江仙據制藥股份有限公司，批號140146，規格：5 mg/片)；右歸丸(北京同仁堂股份有限公司同仁堂制藥廠，國藥準字號Z11021040，規格：9 g/丸)。

1.3 主要試劑及儀器肌酐檢測試劑盒(批號：YZB/GER2659-2018)，尿素氮檢測試劑盒(批號：YZB/GER0315-2018)，總蛋白檢測試劑盒(批號： YZB/GER3253-2018)，白蛋白檢測試劑盒(批號：YZB/GER1029-2018)，三酰甘油檢測試劑盒(批號：YZB/GER5264-2018)，膽固醇檢測試劑盒(批號：YZB/GER1324-2018)，以上均由Roche Diagnostics Gmbh公司提供；全自動生化分析儀(羅氏公司，型號COBASC701)；熒光顯微鏡(上海光學儀器廠，型號XSP-63XDV)。

1.4 實驗分組與給藥60只雄性SPF級Wistar大鼠適應性飼養1周，按體質量隨機分為正常組(10只)和造模組(50只)。參照文獻[7]，造模組大鼠一次性尾靜脈注射阿霉素(6 mg/kg)建立激素抵抗型腎病綜合征大鼠模型，造模成功后采用隨機數字表法分為模型組，激素組，激素中藥高、中、低劑量組，正常組大鼠注射等劑量生理鹽水。2周后，依據人與大鼠用藥量換算方法計算用藥量[8]分別灌胃給藥，正常組、模型組給予等體積生理鹽水灌胃，激素組給予潑尼松片混懸液灌胃，劑量為6.3 mg/(kg·d)；激素聯合中藥高、中、低組給予潑尼松混合右歸丸的混懸液灌胃,劑量分別為6.3/11.6 mg·kg-1·d-1、6.3/5.6 mg·kg-1·d-1、6.3/2.8 mg·kg-1·d-1，連續6周。

1.5 觀察指標

1.5.1 生化指標檢測末次給藥24 h后，將禁食不禁水16 h的動物用10%水合氯醛溶液以0.3～0.4 ml/100 mg腹腔注射，麻醉后心臟采血，用生化管收集血液6～8 ml，靜置2 h后離心。全自動生化儀檢測大鼠血清肌酐、尿素氮、總蛋白、白蛋白、總膽固醇、三酰甘油，24 h蛋白定量采用鄰苯三酚紅/鉬酸鹽比色法。

1.5.2 腎組織Nephrin、Podocin免疫熒光染色固定的腎組織經常規洗滌、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片后行免疫組化法分析相關蛋白表達，染色熒光顯微鏡下觀察拍照。

2 結果

2.1 用藥前后各組大鼠尿蛋白定量比較造模前24 h尿蛋白測定結果顯示，差異無統計學意義P>0.05，具有可比性。至第2周出現大量尿蛋白，當24 h尿蛋白定量>100 mg/kg表明造模成功。除空白組外，其他各組用藥前24 h尿蛋白量比較，P>0.05；用藥前后24 h尿蛋白量比較，模型組顯著增加，除潑尼松組外，各治療組均顯著下降，用藥后與模型組比較，P>0.05；激素中藥組差異有統計學意義(P<0.05)。治療6周后，激素中藥組24 h尿蛋白量顯著下降(P<0.05)，各治療組之間比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

2.2 各組大鼠生化指標比較與空白組比較，模型組TP與ALB水平顯著下降(P<0.05)，總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、肌酐(Scr)與尿素氮(BUN)明顯升高(P<0.05)。提示造模后，AD大鼠體內蛋白流失較為明顯，脂質代謝紊亂，腎功能損傷；與模型組比較，各中藥治療組TP與ALB水平顯著上升(P<0.05),TC、TG、Scr與BUN明顯下降(P<0.05)，潑尼松組無統計學差異(P>0.05)。表明右歸丸對激素抵抗型腎病綜合征大鼠模型各生理指標的恢復和改善治療明顯，且高中低劑量組無明顯差異(P>0.05)，表明治療效果無劑效關系。見表2。

表1 各組大鼠用藥前后尿蛋白定量變化情況 (只，

注：與空白組比較，1)P<0.05；與模型組比較，2)P<0.05；與潑尼松組比較，3)P<0.05

表2 各組大鼠總蛋白、白蛋白及血脂的變化情況 (只，

注：與空白組比較，1)P<0.05；與模型組比較，2)P<0.05；與潑尼松組比較，3)P<0.05

2.3 各組大鼠Nephrin、Podocin的表達免疫熒光染色可見，與空白組比較，其他各組Nephrin、Podocin熒光表達均降低(P<0.05)；與模型組相比較，除激素組外其他各組熒光部分恢復，其表達優于模型組(P<0.05)；激素中藥高劑量組Nephrin、Podocin熒光表達高于中、低劑量組，具有明顯的量效關系。見圖1、圖2。

圖1 Nephrin免疫組化結果(×200)

圖2 Podocin免疫組化結果(×200)

3 討論

激素抵抗型腎病綜合征(steroid-resistant nephrotic syndrome，SRNS)是指經規范化激素治療無效的腎病綜合征，屬于難治性腎病綜合征(refractory nephrotic syndrome，RNS)的一種類型[9]， 是臨床慢性腎臟病中治療最為棘手，預后較差的病種。尾靜脈一次性注射阿霉素復制腎病綜合征模型，已廣泛應用于中藥及其主要成分對腎臟保護作用的藥物篩選[10]。SRNS在病理上以微小病變(MCD)、系膜增生性腎小球腎炎(MesPGN)及局灶階段型腎小球硬化(FSGS)較為常見[11]。本研究采用此方法造模后，模型組大鼠在造模2周后出現大量的蛋白尿，生化指標變化明顯，腎臟組織病理出現FSGS征象，表明實驗成功建立了SRNS大鼠模型。

蛋白尿是CKD進展的獨立危險因素，足細胞的損傷是導致蛋白尿的關鍵環節，同時大量的研究發現，足細胞相關蛋白基因的突變是激素抵抗型腎病綜合征的本質。足細胞裂孔隔膜(slit diaphragm，SD)是覆蓋于足突裂隙間一層拉鏈樣膜狀電子致密結構，其不僅是血漿蛋白濾過的主要分子屏障，裂孔隔膜相關蛋白亦作為一個信號轉導平臺參與足細胞正常生理功能調節[12]。而足細胞結構功能的異常及損傷與足細胞裂孔隔膜蛋白“Nephrin、Podocin、CD2AP”表達異常密切相關。在病理條件下，裂孔隔膜信號平臺的關鍵分子異常表達，最終導致激素抵抗型腎病綜合征的發生。Nephrin、Podocin、CD2AP相互作用所形成的分子鏈可能是SD的功能單位，與蛋白尿有直接的關系；調控Nephrin、Podocin、CD2AP表達，就可以改善SD結構，減少蛋白尿，降低SRNS這一事件的發生。本實驗中，給藥6周后模型組Nephrin、Podocin的表達量明顯減少，各治療組除激素組外其他各組Nephrin、Podocin的分布部分恢復，表達高于模型組，且24 h尿蛋白定量、血脂、腎功能改變顯著。由此可見，Nephrin、podocin的表達變化與SRNS大鼠尿蛋白的形成有一定的關系。右歸丸是明代醫家張景岳根據《難經·三十六難》中“左腎，右命門”的理論而創制，因右腎屬火主陽，故“右歸””是“溫陽補腎，使元陽得歸其原”之義。導師戴恩來教授在中藥對SRNS增敏研究中發現腎病綜合征中醫辨證為脾腎陽虛證的患者，且在運用激素治療的過程中陽虛證候不易改善者，療效較差，而當輔以溫補腎陽藥物時，患者對激素的敏感性明顯增強[13]。同時臨床發現運用右歸丸能降低患者耐藥基因MDR1、P-gp170的表達、上調GRα的表達，從而增加SRNS患者對糖皮質激素的敏感性。本研究中右歸丸聯合潑尼松組的相關指標明顯優于激素組，由此可見，采用中西醫雙重診斷，中西病癥結合模式能有效改善諸多臨床癥狀。

通過實驗可見，右歸丸聯合激素可以緩解AD誘導的SRNS大鼠病變進程，它能有效提升血清總蛋白、白蛋白，降低24 h尿蛋白、血肌酐和血尿素氮，促進足細胞裂孔膈膜功能的修復，保持Nephrin、Podocin表達的完整性。我們推斷，右歸丸對激素的增敏作用，可能是保護腎臟，延緩SRNS進展的作用機制之一。