結核分枝桿菌H37Rv新基因Rv2742克隆表達及純化

趙加玲，武舒佳，王紅，李芊璘，孫金帥，常蕾，戴二黑，武軍駐，張瑤,6，徐平

結核分枝桿菌H37Rv新基因克隆表達及純化

趙加玲1,3，武舒佳2,3，王紅3,4，李芊璘4，孫金帥3,5，常蕾3，戴二黑4，武軍駐2，張瑤3,6，徐平1,3

1 武漢大學 藥學院，湖北 武漢 430000 2 武漢大學 基礎醫(yī)學院，湖北 武漢 430000 3 軍事科學院軍事醫(yī)學研究院生命組學研究所 國家蛋白質科學中心 (北京) 北京蛋白質組研究中心 蛋白質組學國家重點實驗室，北京 102206 4 華北理工大學 公共衛(wèi)生學院和附屬石家莊市第五醫(yī)院，河北 唐山 063210 5 河北大學 生命科學學院，河北 保定 071000 6 中山大學 生命科學學院，廣東 廣州 510275

是本課題組前期基于蛋白質基因組學策略從結核分枝桿菌H37Rv中發(fā)現(xiàn)、鑒定的遺漏注釋基因。文中旨在建立結核分枝桿菌H37Rv漏注釋蛋白Rv2742的可溶性誘導表達、純化體系，為進一步探索基因參與的生物學功能奠定基礎。前期實驗發(fā)現(xiàn)構建的pGEX-4T- 2-、pET-28a-、pET-32a-及pMAL-c2X-原核表達載體均無法實現(xiàn)目的蛋白的誘導表達。但經(jīng)密碼子優(yōu)化后，僅有pMAL-c2X-載體能夠實現(xiàn)目的蛋白的可溶性誘導表達。此外，通過比較不同宿主菌、溫度及IPTG濃度對目的蛋白表達量的影響，發(fā)現(xiàn)目的蛋白在(DE3)中，16℃及0.5 mmol/L IPTG誘導條件下表達量最高。直鏈淀粉樹脂 (Amylose resin) 親和層析柱純化獲得較純的產(chǎn)物，經(jīng)LC-MS/MS驗證確認是Rv2742融合蛋白肽段序列。成功獲得結核分枝桿菌H37Rv新基因的重組蛋白，可進一步開展其潛在相互作用及免疫原性研究工作。

結核分枝桿菌，新基因，原核表達，親和純化

結核分枝桿菌(，MTB) 是引起人類結核病的病原菌[1]，可入侵多種組織、器官如胸膜、淋巴管、泌尿生殖器和骨關節(jié)炎等[2]，但以肺結核最為常見。據(jù)2018年WHO報道，2017年全球約有130 萬人死于該病，有1 000萬新病例發(fā)生。結核病仍然是傳染性疾病中的頭號殺手。我國依然是全球結核高發(fā)病、高耐藥、高HIV共感染負擔國家之一[3]。因此，有效的早期診斷新方法和及時治療是控制結核疫情蔓延的重要手段[4]。

目前，臨床常用的診斷方法包括涂片顯微鏡法、細菌培養(yǎng)法、核酸擴增試驗(如GeneXpert MTB/RIF)、結核菌素皮膚試驗(TST)、γ干擾素釋放試驗(IGRA) 等[5]，但存在涂片染色檢出率低、培養(yǎng)周期長、結核抗原特異性差和靈敏度不高等問題。其中，結核菌素皮膚試驗因與卡介苗(BCG) 及非結核分枝桿菌之間存在交叉反應而導致特異性不高[6]，而基于ESAT-6與CFP-10研發(fā)的T-SPOT試劑盒雖被廣泛地用于臨床結核菌感染的篩查，但仍存在“陽性不能確證，陰性不能排除”的弊端，不能有效區(qū)分活動性結核患者和潛伏感染者[7]。因此，尋找能夠有效區(qū)分活動性結核患者和潛伏感染者高特異性、靈敏性的有效抗原可解決結核臨床診斷的難題。

1998年，Cole等[8-9]基于全基因組鳥槍法和系統(tǒng)測序法，完成了結核分枝桿菌H37Rv的基因組測序和注釋工作。2002年，Camus等[10]通過EMBL、TrEMBL和SWISS-PROT三個數(shù)據(jù)庫序列同源性比較，補充了82個新編碼基因。傳統(tǒng)的基因組注釋是利用已知的基因特征和同源性比較實現(xiàn)的，難以發(fā)現(xiàn)人類未知的、新基因結構特征的基因，造成這些生物學功能和對菌株鑒別可能重要的基因遺漏，逃離人類研究的視線，形成盲區(qū)。國內外研究者基于算法優(yōu)化[10]、基因預測軟件及注釋工具開發(fā)、轉錄組學和蛋白質組學[11-15]、比較基因組學[16]等策略，一直在校正和完善H37Rv基因組注釋數(shù)據(jù)庫。然而，MTB屬于原核生物，受基因組測序質量影響以及缺乏合適的校正評估方法，原核生物基因組注釋中尚可能存在注釋錯誤[17](過度注釋；ORF起始、終止位點注釋錯誤；可變剪接；核糖體移位；漏注釋等)，給準確解析相應物種的生物學機制帶來了困擾[18]。

利用蛋白質組學數(shù)據(jù)，結合基因組數(shù)據(jù)、轉錄組數(shù)據(jù)來研究基因組注釋問題，被稱為蛋白質基因組學(Proteogenomics)[19]。近10年來，蛋白質組學直接用于基因組的注釋已經(jīng)越來越受到相關領域的關注。本課題組前期基于深度覆蓋的精準蛋白質基因組學技術[20,24]和比較基因組學策略，完成了H37Rv基因組數(shù)據(jù)庫的重注釋，發(fā)現(xiàn)了22個結核遺漏注釋基因，矯正了28個N端注釋錯誤基因(圖1，尚未發(fā)表)。此發(fā)現(xiàn)有利于結核新型特異性免疫原性分子標志物篩選，為結核病的快速、精準臨床檢測提供基礎理論和原始創(chuàng)新技術支持。

從TubercuList庫中下載了H37Rv (http:// genolist.pasteur.fr/TubercuList/) 基因組注釋數(shù)據(jù)庫，共4 031個基因，包含4 018個編碼基因和13個假基因。六閱讀框翻譯數(shù)據(jù)庫由中國科學院計算技術研究所pFind團隊與我們課題組合作開發(fā)的蛋白質基因組學軟件pAnno對NCBI中結核分枝桿菌H37Rv的基因組文件(NC000962.3.fna) 按照正鏈和互補鏈上連續(xù)的3個核苷酸翻譯一個氨基酸的規(guī)則翻譯，使用終止子到終止子的翻譯模式，采用MTB特殊的3種起始密碼子ATG、GTG和TTG，共翻譯得到141 851個開放閱讀框(Opening reading frame，ORF)。與已注釋的蛋白質序列數(shù)據(jù)庫進行合并，經(jīng)過嚴格FDR篩選，結合譜圖人工核實、肽段合成驗證、轉錄豐度、基因組多序列比對，獲得了一批質量可信的新肽段，完成了H37Rv新編碼基因的驗證和原先注釋錯誤基因的矯正。

圖1 結核分枝桿菌H37Rv蛋白質基因組學分析流程圖

基因是我們發(fā)現(xiàn)的H37Rv遺漏注釋基因之一(根據(jù)基因在染色體的坐標位置及結核基因命名法進行命名)。前期深度覆蓋質譜數(shù)據(jù)共鑒定到兩條肽段即“PNPWQYIR”和“VHNLDPEL VDEHAR”，化學合成肽段與原先鑒定肽段譜圖相似性分別為0.94和0.96，意味著基因成功被轉錄、翻譯。T細胞表位預測(https://www.iedb. org/) 發(fā)現(xiàn)，Rv2742新蛋白中高可信的T細胞表位數(shù)有19個(>0.5分)，高可信T細胞表位覆蓋到該蛋白66.42%的序列，與已知表位庫比較，都是新型的表位，該蛋白具有很好的免疫原性。此外，經(jīng)NCBI-BLASTP后，數(shù)據(jù)庫中沒有比對到相似序列，屬于功能未知蛋白。為進一步探索新基因功能及其潛在臨床應用價值，有必要建立其表達、純化體系。

本研究比較了4種不同的原核表達載體(pGEX-4T-2、pET-32a、pET-28a和pMAL-c2X)、密碼子利用偏性、5種宿主(JM109 (DE3)、BL21、BL21 (DE3)、BL21 (DE3) pLysS和(DE3))、不同誘導溫度(16 ℃和28 ℃)、不同IPTG濃度(0.5 mmol/L和1.0 mmol/L) 等條件下，目的蛋白的表達量。旨在最優(yōu)實現(xiàn)結核分枝桿菌H37Rv新編碼基因克隆、可溶性誘導表達，從而能高效純化Rv2742蛋白，為后續(xù)開展該蛋白的潛在相互作用及免疫原性研究奠定基礎。后期實驗采用的質譜方法是基于“自下而上”(Bottom-up) 鳥槍法的策略[21]，其基本流程是首先將蛋白質酶解為肽段，再用反相液相色譜進行分離，被洗脫的肽段用串聯(lián)質譜(一級質譜和二級質譜) 檢測，最后利用搜庫軟件對樣品中的肽段和蛋白質進行鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及質粒

H37Rv菌株DNA來自河北省石家莊市第五醫(yī)院。大腸桿菌DH5α、BL21 (DE3) 及BL21 (DE3) pLysS感受態(tài)細胞均購自北京康為世紀生物科技有限公司。大腸桿菌BL21及(DE3) 感受態(tài)細胞均購自北京全式金生物技術有限公司。JM109 (DE3) 感受態(tài)細胞購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司。pGEX-4T-2為本實驗室保存質粒；pET-28a質粒由國家蛋白質科學中心田春艷博士饋贈；pET-32a質粒由德陽生物技術(固安) 有限責任公司技術總監(jiān)趙明治博士饋贈；pMAL-c2X質粒由華大青蘭生物科技(無錫)有限公司饋贈。引物合成和測序均由北京擎科新業(yè)生物技術有限公司完成。

1.1.2 主要試劑

DNA marker (DL 1 000、λ-d Ⅲ)、pMD18-T 載體試劑盒均購自寶生物工程有限公司(大連)；2×PCR Master Mix、DNA膠回收試劑盒、質粒DNA提取試劑盒均購自天根生化科技有限公司(北京)；限制性內切酶(HⅠ、d Ⅲ、RⅠ、Ⅰ、Ⅰ、Ⅰ及直鏈淀粉樹脂均購自紐英倫生物技術公司(美國)；注射用氨芐西林鈉購自石藥集團中諾藥業(yè)有限公司；蛋白marker (10 kDa) 購自富酶泰斯公司(加拿大)；瓊脂糖購自Biowest公司(法國)；耐自消化高活性乙酰化胰蛋白酶來自北京酶知源生物科技有限公司[22-23]。

1.1.3 主要儀器設備

PCR儀、凝膠電泳電源、凝膠成像系統(tǒng)、DNA電泳儀、電泳槽均為BIO-RAD (美國) 公司產(chǎn)品；冷凍離心機、搖床、LTQ Orbitrap Velos質譜儀均為Thermo Fisher Scientific (美國) 公司產(chǎn)品；紫外分光光度計為島津公司(日本) 產(chǎn)品；純水儀為Merck Millipore (德國) 公司產(chǎn)品；電熱恒溫水浴鍋為北京長風公司產(chǎn)品；電熱恒溫培養(yǎng)箱為上海一恒科學儀器有限公司產(chǎn)品；超聲波細胞粉碎機為寧波新芝生物科技股份有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 重組表達質粒的構建

以H37Rv DNA為模板，引物如表1所示，分別擴增獲得新基因片段。PCR反應體系均為：ddH2O 9.5 μL、2×PCR Master Mix 12.5 μL、DNA 1 μL、上下游引物各1 μL。PCR反應條件：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性 1 min，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。

PCR產(chǎn)物利用DNA回收試劑盒回收，與pMD18-T克隆載體于16 ℃過夜連接。連接體系為T4 DNA連接酶緩沖液1 μL、T4 DNA連接酶1 μL、ddH2O 3 μL、pMD18-T克隆載體0.5 μL、目的片段回收產(chǎn)物4.5 μL。將連接產(chǎn)物轉化至DH5α感受態(tài)細胞。菌落PCR鑒定為陽性的質粒送至北京擎科新業(yè)生物技術有限公司進行測序。NCBI在線比對為陽性的質粒命名為pMD18T-。

上述測序正確的質粒分別與其相應的載體(pGEX-4T-2、pET-32a、pET-28a或pMAL-c2X)分別利用HⅠ/Ⅰ或RⅠ/d Ⅲ進行雙酶切。雙酶切體系為ddH2O 24 μL、質粒20 μL、NE緩沖液3.1 5 μL，HⅠ(0.3 μL)/Ⅰ(0.5 μL)或RⅠ/d Ⅲ (各0.3 μL) 37 ℃雙酶切6 h，DNA回收試劑盒分別回收目的基因及載體片段，經(jīng)T4 DNA連接酶16 ℃過夜連接。連接體系為T4 DNA連接酶緩沖液1 μL，T4 DNA連接酶 1 μL，ddH2O 3 μL，表達載體雙酶切產(chǎn)物1 μL，目的片段回收產(chǎn)物4 μL。將連接產(chǎn)物10 μL轉化至DH5α感受態(tài)細胞，菌落PCR為陽性的質粒命名為pGEX-4T-2--1、pET-32a--1、pET-28a--1及pMAL-c2X--1。

1.2.2基因密碼子優(yōu)化及優(yōu)化產(chǎn)物重組表達質粒的構建

依據(jù)大腸桿菌密碼子偏好性，將基因序列進行密碼子優(yōu)化。對優(yōu)化后的基因片段進行引物設計(表1)，操作步驟同前。將連接產(chǎn)物轉化至DH5α感受態(tài)細胞，菌落PCR驗證為陽性的質粒分別命名為pGEX-4T-2--2、pET-32a--2、pET-28a--2、pMAL-c2X--2。

重組質粒分別轉化BL21 (DE3) 宿主菌，挑取單菌落于5 mL LB (含100 μg/mL Amp/Kana) 液體培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)。以起始600=0.1接種于50 mL LB (含100 μg/mL Amp/Kana)液體培養(yǎng)基中。37 ℃振蕩培養(yǎng)至600為0.6–0.8時，加入終濃度為１ mmol/L的IPTG，28 ℃、200 r/min誘導6–8 ｈ。分別收取誘導前后14菌體，離心后用預冷的PBS洗滌兩次，加入等體積裂解液(PBS+1 mmol/L PMSF+0.5% Triton X-100)超聲破碎，分別取上清和沉淀進行SDS-PAGE，比較IPTG誘導前后目的蛋白的表達情況。

1.2.4 Rv2742新蛋白誘導表達條件的優(yōu)化

將重組質粒pMAL-c2X-Rv2742-2取0.5 μL分別轉化至表達宿主菌JM109 (DE3)、BL21、BL21 (DE3)、BL21 (DE3) pLysS及Rosetta (DE3) 中，28 ℃、終濃度為1 mmol/L的IPTG誘導表達6–8 h，比較不同宿主菌對目的蛋白表達量的影響。基于表達量較高的宿主進行不同溫度(16 ℃和28 ℃)、不同IPTG濃度(終濃度為0.5 mmol/L和1.0 mmol/L) 過夜誘導，比較誘導條件對目的蛋白表達量的影響。10% SDS-PAGE檢測目的蛋白表達情況。

表1 引物序列

.-1 represented the primer before codon optimization while -2 represented the primer after codon optimization. The single underlined sequences indicate restriction enzyme site.

1.2.5 Rv2742融合蛋白的純化及LC-MS/MS鑒定

將誘導后上清經(jīng)直鏈淀粉樹脂(Amylose resin)柱(100 μL) 4 ℃孵育1 h，用清洗液 (20 mmol/L Tris-HCl (pH 7.4)、200 mmol/L NaCl、1 mmol/L EDTA、1 mmol/L 二硫蘇糖醇、1 mmol/L 苯甲基磺酰氟、0.5% Triton X-100) 500 μL洗3次，用洗脫液(清洗液+10 mmol/L麥芽糖) 100 μL洗脫2次，純化得到目的融合蛋白，10% SDS-PAGE檢測。經(jīng)考馬斯亮藍R-250染色并脫色后檢測目的融合蛋白的純化情況。

將純化的目的條帶切成1 mm3膠粒，脫色、脫水、蒸干、經(jīng)乙酰化胰蛋白酶(10 ng/μL) 37 ℃過夜消化、抽提肽段、蒸干后置?80 ℃凍存。

蒸干后的肽段使用上樣緩沖液(1% ACN+1% FA+98% ddH2O) 進行充分溶解。通過超高壓液相色譜進行分離，其中分離柱采用內徑75 μm長 15 cm的C18反相色譜分析柱，內部C18填料內徑3 μm。洗脫組分經(jīng)納升級電噴霧離子源接口噴 出進入LTQ Orbitrap Velos分析。毛細管離子傳輸溫度為250 ℃，電噴霧電壓為1.8 kV。質譜采用一級質譜數(shù)據(jù)依賴的二級質譜掃描模式(Data dependent MS/MS scan) 碰撞誘導裂解(Collision-induced dissociation，CID) 模式碎裂一級離子。一級質譜掃描質核比范圍為300– 1 600 (/)，分辨率設置為30 000；自動增益控制(Automatic gain control，AGC) 為106。依次選取一級信號強度最高的20個離子進行二級碎裂分析，碰撞歸一化能量(Normalized collision energy，NCE)為35%；AGC為104；最大離子注入時間為30 ms；動態(tài)排除(Dynamic exclusion)為40 s(40s內不重復掃描已檢測母離子)[24]。

“是的。Y的行為是S一直想不通的。小說家也沒跟我講清楚，也許故事中的那個男人也不清楚。S曾以為那只是跟曲三年契約造成的后遺癥，但看來已不限于這件事了。總之，事情很復雜，距離結束還遠著呢。你還想聽嗎？”

1.2.6 數(shù)據(jù)庫搜索

pFind3 (https://github.com/pFindStudio/pFind3/ issues)對質譜產(chǎn)生的數(shù)據(jù)文件(.raw) 進行蛋白質數(shù)據(jù)庫搜索。數(shù)據(jù)庫由從UniProt (Version：201601)下載目標完整蛋白質組序列、結核分枝桿菌H37Rv遺漏注釋蛋白Rv2742序列、pMAL-c2X載體標簽MBP蛋白序列和常見污染構成。搜庫參數(shù)設置如下：1) 胰酶特異性酶切(Trypsin KR_C)；2) 固定修飾為半胱氨酸的烷基化修飾Carbamidomethyl[C] (+57.021 46 Da)；3) 可變修飾為甲硫氨酸氧化修飾Oxidation[M] (+15.994 92 Da)；4) 母離子質量誤差20 ppm；5) 子離子質量誤差0.5 Da；6)允許最大漏切位點數(shù)目為2個；7) 7 AA≤肽段長度≤100 AA；8)肽段最大修飾為2種。搜庫結果采用目標-誘餌庫策略進行過濾，并設定肽段和蛋白質鑒定假陽性率(False discovery rate，F(xiàn)DR) 均小于1%[25]。

1.2.7 IPTG誘導表達Rv2742蛋白生長曲線的測定

將重組質粒pMAL-c2X--2取0.5 μL轉化至BL21 (DE3)，挑取單菌落擴大培養(yǎng)于5 mL LB (含100 μg/mL Amp) 液體培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)。采用比濁法，分光光度計波長為600 nm檢測。用LB液體培養(yǎng)基調零，以起始600為0.1接種于5 mL LB (含100 μg/mL Amp) 液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)。待菌體生長至對數(shù)期，實驗組加入終濃度為1 mmol/L的IPTG誘導，設置3組生物學重復，每隔1.5 h檢測值。

2 結果與分析

2.1 重組表達質粒的構建

重組表達質粒構建方法類似，以 pMAL-c2X--2為例。以密碼子優(yōu)化后的序列為模板擴增，獲得基因片段約420 bp，與預期的目的片段大小一致(圖 2A)，表明成功獲得目的基因。純化的目的片段與pMD 18-T連接轉化后進行菌落PCR驗證，在目的條帶處成功獲得特異性條帶(圖 2B)，且測序序列正確。RⅠ和d Ⅲ雙酶切pMD 18T-質粒6 h，酶切片段約為420 bp，與預期大小相符(圖2C)。RⅠ和d Ⅲ雙酶切質粒pMAL-c2X，酶切片段約為6 478 bp (圖2 D)，與預期相符。將雙酶切后回收的目的片段與載體片段連接轉化進行菌落PCR驗證，在目的條帶處獲得特異性條帶(圖2E)，說明成功構建重組表達質粒pMAL-c2X--2。

2.2 四種表達載體均未實現(xiàn)Rv2742目的蛋白的誘導表達

經(jīng)Glycine-SDS-PAGE或Tricine-SDS-PAGE[26]電泳結果分析，如圖3A所示，發(fā)現(xiàn)在28 ℃ 1 mmol/L IPTG誘導6 h后，pGEX-4T-2系統(tǒng)表達的Rv2742目的融合蛋白(分子量為40.85 kDa) 主要分布在沉淀中，但在誘導后上清中并沒有明顯的新增條帶，說明以pGEX-4T-2系統(tǒng)表達的Rv2742目的融合蛋白主要以包涵體形式存在。如圖3B、3C、3D所示，分別以pET-32a、pET-28a、pMAL-c2X系統(tǒng)表達的Rv2742目的融合蛋白(分子量分別為28.16、18.04、56 kDa) 在誘導后上清與沉淀中均未出現(xiàn)明顯的新增特異性條帶，說明以pET-32a、pET-28a以及pMAL-c2X表達的Rv2742目的融合蛋白均未能成功實現(xiàn)誘導表達。綜上所述，以H37Rv基因組DNA克隆的基因序列為模板所構建的pGEX-4T-2--1、pET-32a--1、pET-28a--1、pMAL- c2X--1原核表達系統(tǒng)均未能實現(xiàn)Rv2742目的蛋白可溶性誘導表達。

2.3 Rv2742基因序列密碼子優(yōu)化前后比較

參考大腸桿菌的密碼子偏好性，對序列進行密碼子優(yōu)化，經(jīng)DNAMAN序列比對密碼子優(yōu)化前后序列，結果如4A所示。參照GenScript (http://www.genscript.com/) 中同義密碼子的相對頻率將密碼子分為3類：高頻密碼子、常用密碼子及稀有密碼子[27]，并對優(yōu)化前后的密碼子進行統(tǒng)計分類，結果如4B所示，表明優(yōu)化前的含8.15%的稀有密碼子且高頻密碼子所占比例小(28.15%)。對序列的密碼子適應指數(shù)(Codon adaptation index，CAI) 計算，發(fā)現(xiàn)新編碼基因的CAI從0.73升高到0.92，如圖4C所示，結果顯示經(jīng)密碼子優(yōu)化后更適于大腸桿菌的原核表達，這為的原核表達提供有利的理論依據(jù)。統(tǒng)計結果發(fā)現(xiàn)優(yōu)化前的密碼子適應度普遍偏低，且最適于表達的密碼子占51% (91–100)，而不適于表達的密碼子占9% (0–30)，結果如圖4D所示，優(yōu)化后減少了的稀有密碼子和適應度低的密碼子，不適于表達的密碼子僅占2% (0–30)，同時增加了高頻密碼子的使用，使得最適密碼子增加到86% (91–100)，有效地提高了其轉錄和翻譯的效率。

圖2 重組表達質粒pMAL-c2X-Rv2742-2構建及鑒定

圖3 分別利用pGEX-4T-2、pET-32a、pET-28a、pMAL-c2X四種表達載體表達Rv2742重組蛋白的Glycine-SDS-PAGE/Tricine-SDS-PAGE圖譜(Rv2742密碼子優(yōu)化前)

2.4 Rv2742新基因密碼子優(yōu)化后實現(xiàn)了目的蛋白的誘導表達

以密碼子優(yōu)化后的序列為模板，將構建成功的重組質粒pGEX-4T-2--2、pET- 32a--2、pET-28a--2分別轉化至大腸桿菌BL21 (DE3) 中，28 ℃、終濃度為1 mmol/L IPTG誘導6 h后，經(jīng)Glycine-SDS-PAGE或Tricine- SDS-PAGE分析，如圖5A、5B、5C所示，IPTG誘導后的上清和沉淀中均未出現(xiàn)明顯新增條帶，表明密碼子優(yōu)化后，pGEX-4T-2、pET-32a、pET-28a原核表達系統(tǒng)均未能實現(xiàn)Rv2742重組蛋白的誘導表達(分子量分別為40.85 kDa、28.16 kDa、 18.04 kDa)。而將含重組質粒pMAL-c2X--2的大腸桿菌BL21 (DE3) 在28 ℃、終濃度為1 mmol/L IPTG誘導6 h。10% Glycine-SDS-PAGE顯示，與未加IPTG誘導前相比，誘導后上清和沉淀均在56 kDa出現(xiàn)特異性新增條帶，其大小與目的蛋白預期相符。初步說明目的片段在大腸桿菌pMAL-c2X表達系統(tǒng)中得到了表達，且表達產(chǎn)物能以可溶性蛋白形式出現(xiàn)，但表達量不高(圖5D)。

圖4 Rv2742基因序列密碼子優(yōu)化前后差異的比較

2.5 宿主菌Rosetta (DE3) 實現(xiàn)了目的蛋白的高表達及誘導條件的優(yōu)化

將重組質粒pMAL-c2X--2分別轉化至宿主菌JM109 (DE3)、BL21、BL21 (DE3)、BL21 (DE3) pLysS及Rosetta (DE3) 中，28 ℃、終濃度為1 mmol/L IPTG誘導6–8 h。10% SDS-PAGE結果顯示，Rv2742目的蛋白雖在其他4個宿主菌JM109 (DE3)、BL21、BL21 (DE3)、BL21 (DE3) pLysS中均實現(xiàn)了可溶性誘導表達，但在Rosetta (DE3) 宿主菌中的表達量尤為顯著(圖6A)。在Rosetta(DE3)宿主菌、終濃度為1 mmol/L IPTG誘導條件下，我們比較了28 ℃ (6–8 h) 和16 ℃ (12 h)溫度下目的蛋白的表達量，結果表明目的蛋白在16 ℃低溫誘導時表達量更高(圖6B)。在Rosetta (DE3) 宿主菌及16℃過夜誘導條件下，我們比較了終濃度為1 mmol/L和0.5 mmol/L IPTG對目的蛋白表達量的影響，結果表明目的蛋白在終濃度為0.5 mmol/L IPTG誘導條件下表達量最高(圖6B)。綜上所述，在宿主菌Rosetta (DE3)、16 ℃及終濃度為0.5 mmol/L IPTG過夜誘導條件下能更有效地實現(xiàn)Rv2742蛋白的融合表達。

圖5 分別利用pGEX-4T-2、pET-32a、pET-28a、pMAL-c2X四種表達載體表達Rv2742重組蛋白的SDS-PAGE/Tricine-SDS-PAGE圖譜(Rv2742密碼子優(yōu)化后)

2.6 Rv2742目的融合蛋白的純化及LC-MS/ MS鑒定

在Rosetta (DE3) 宿主菌中，16 ℃、終濃度為0.5 mmol/L IPTG過夜誘導表達的上清超聲裂解后親和純化(圖7A)，在56 kDa處獲得純度較高的Rv2742目的融合蛋白。經(jīng)LC-MS/MS鑒定，pFind 3搜庫鑒定到4條Rv2742目的蛋白高可信肽段，分別為MSDNAIRP、PNPWQYIR、YGPRPDPND、VHNLDPELVDEHAR (圖7C)。計算得到Rv2742目的蛋白鑒定肽段序列覆蓋度達29.63% (圖7B), 而Rv2742融合蛋白鑒定肽段序列覆蓋度高達61.46%。說明經(jīng)過宿主菌、低溫、低濃度IPTG誘導條件優(yōu)化后，純化得到含量更高的Rv2742融合蛋白，為后續(xù)進一步的功能研究提供必要的條件。

2.7 IPTG誘導表達Rv2742蛋白生長曲線的測定

將重組質粒pMAL-c2X--2取0.5 μL轉化至大腸桿菌Rosetta (DE3) 中。如圖8所示，未加IPTG誘導組(?IPTG) 在整個時間段內保持正常生長，經(jīng)過對數(shù)期后達到平臺期。而與對照組(?IPTG) 相比，加入IPTG誘導(+IPTG) 組的生長情況明顯受到抑制，誘導后0–1.5 h范圍內值只有少量增加且誘導3 h后菌體值基本維持穩(wěn)定。由于IPTG是一種極強的誘導劑，不被細菌代謝因而十分穩(wěn)定，在胞內誘導外源蛋白的表達，會對細胞產(chǎn)生一定的毒性。其次，加入IPTG后，大量外源蛋白的表達造成菌體原有代謝活動的失衡和重新分配。對于菌體內源蛋白來說，是一種對游離氨基酸以及核糖體的競爭和掠奪，這必然會影響內源蛋白的合成速度，導致菌體的生長受到明顯抑制，生長速度降低。

圖6 Rv2742融合蛋白在五種不同宿主菌中誘導表達及在Rosetta (DE3) 宿主菌中誘導條件的優(yōu)化

圖7 Rv2742目的融合蛋白純化及質譜檢測

圖8 IPTG誘導表達Rv2742蛋白生長曲線的測定

3 討論

大腸桿菌是一種基因組G+C含量低(<50%)的革蘭氏陰性菌，而結核分枝桿菌() 是一種基因組G+C含量高(>65%) 的革蘭氏陽性放線菌[28]，放線菌基因組的典型特征就是基因組G+C含量高。結核分枝桿菌G_和C_結尾末端的密碼子具有很強的偏倚性，第3個位點的密碼子(G+C) 含量高達83%[29]。密碼子偏倚性影響翻譯過程中氨基酸插入的準確性、多肽折疊和mRNA序列的穩(wěn)定性等幾方面[30]。結核分枝桿菌目的基因在大腸桿菌中不易表達可能主要是由于G+C含量高和獨特密碼子的使用[31]。生物體中基因所使用的密碼子和tRNA的豐度有著強的正相關性。依照物種的偏好性對mRNA的序列進行優(yōu)化，將目的基因的密碼子替換成宿主細胞常用的密碼子，能夠增加tRNA的結合效率從而提高蛋白質表達水平。

本次實驗研究的結核新基因編碼蛋白分子量本身不大，pET-32a和pET-28a雖然同屬pET載體，標簽大小對小蛋白的表達有一定程度的影響，所以在實驗過程中考慮到使用不同種類和大小標簽的pET載體。但僅在密碼子優(yōu)化后，利用pMAL-c2X原核表達系統(tǒng)才在上清和沉淀中都實現(xiàn)了表達，沉淀中表達含量要比可溶性部分高。后續(xù)實驗需要進一步考慮對以包涵體形式表達的蛋白進行變性和復性。誘導后上清雖然實現(xiàn)了可溶性誘導表達，但表達含量較低，可從溫度、IPTG濃度、抗生素濃度、誘導時間、宿主菌等多方面進行優(yōu)化，從而提高其表達量。本次實驗從宿主菌、溫度、IPTG濃度等方面進行優(yōu)化，在Rosetta (DE3) 宿主菌中的表達量尤為顯著。低溫及低濃度誘導劑的條件有利于蛋白的可溶性表達。Rosetta (DE3) 是攜帶氯霉素抗性質粒BL21的衍生菌，補充大腸桿菌缺乏的6種稀有密碼子(AUA、AGG、AGA、CUA、CCC、GGA) 對應的tRNA，提高外源基因在該系統(tǒng)中的表達水平，為其他結核遺漏注釋基因的表達、純化提供了較好的宿主選擇性。

在進行原核表達時，目前多以融合蛋白形式表達，具有融合標簽的表達載體可促進蛋白質可溶性表達和正確折疊恢復成天然結構。融合蛋白標簽的選擇很重要，源于其可能影響天然蛋白質的相互作用、翻譯后修飾、重組蛋白的溶解度和細胞定位等[32]，其應用取決于對特異性、溶解度、結合和洗脫條件等的要求[33]。添加非肽融合配體具有作為溶解度增強劑作用的優(yōu)點[34]。最常用的融合標簽有：麥芽糖結合蛋白(MBP)、轉錄終止/抗終止蛋白NusA)、硫氧還蛋白(Trx)、谷胱甘肽巰基轉移酶(GST)、ubiquitin、SUMO等[35]，但這些融合伴體作為溶解度增強劑起作用的原因尚不清楚。在MBP標簽存在情況下，其具有內在 的分子伴侶活性促進溶解影響其融合伴侶的折 疊[36]。谷胱甘肽巰基轉移酶(GST) 可以結合到谷胱甘肽樹脂上進行純化，可以保護目的蛋白免受蛋白酶降解，增加蛋白的穩(wěn)定性。但GST是一個很弱的溶解度增強劑[37]，易產(chǎn)生包涵體。而NusA、MBP和Trx顯示出較好的溶解度增強特性，但它們的大分子量可能對蛋白質溶解度造成一定的影響[38]。pET-32a含有基因并攜帶有用于蛋白生產(chǎn)和純化的雙融合伴侶。TrxA是一種存在于大腸桿菌胞質中高度可溶性表達的細胞內熱穩(wěn)定性蛋白，能顯著增加重組蛋白的可溶性，減少包涵體形成。但TrxA沒有內在的親和特性，因此在蛋白質純化時需要附加額外的融合標簽，如His6標簽[39]。His標簽在天然和變性的純化條件下被用來幫助溶解和折疊[40]。

啟動子在控制相關基因的轉錄起始中起重要作用。本實驗研究中運用了4種原核表達系統(tǒng)均能被IPTG誘導，表達載體pGEX-4T-2和pMAL-c2X均帶有強大的tac啟動子。tac啟動子由trp啟動子?35區(qū)和lac UV5啟動子?10區(qū)融合而成的雜合啟動子，受lac阻抑物調控[41]。在pET系列表達載體中，外源基因在表達時受T7噬菌體RNA聚合酶調控，編碼序列在多克隆位點插入，置于天然T7 RNA聚合酶啟動子(φ10啟動子) 或所謂的“T7 lac啟動子”的控制之下，后者是帶有l(wèi)ac操縱子(lacO) 序列的天然T7 RNA聚合酶啟動子的衍生體，lac阻抑物的結合能阻斷轉錄起始[42]。

對于特異性抗原的篩選，一直是結核分枝桿菌研究中的重點。基于串聯(lián)質譜的蛋白質組學被應用于注釋基因的鑒定、新基因的發(fā)現(xiàn)、個人基因組學和疾病相關研究[43]。本實驗通過對結核分枝桿菌H37Rv新基因進行克隆、誘導表達和純化，純化后的目的蛋白有可能直接作為抗原或制備抗體建立免疫學檢測方法，為特異性診斷試劑盒和新型疫苗的研制奠定基礎。H37Rv新基因在結核三大數(shù)據(jù)庫(UniProt、NCBI、TubercuList) 中均沒有記錄，其功能目前尚未可知，但其表達豐度較高，只是基于成熟的預測模型沒有預測出來。這種高表達漏注釋基因產(chǎn)物可能在結核分枝桿菌中發(fā)揮了某些特殊的生物學功能，值得進一步探索。

目的基因密碼子優(yōu)化、可溶性融合標簽篩選及宿主菌、溫度、IPTG濃度等表達條件的優(yōu)化是實現(xiàn)蛋白在大腸桿菌中可溶性誘導表達的有效策略[44]。

[1] Rijo P, Sim?es MF, Francisco AP, et al. Antimycobacterial metabolites from: royleanone derivatives againststrains. Chem Biodivers, 2010, 7(4): 922–932.

[2] Eddabra P, Benhassou HA. Rapid molecular assays for detection of tuberculosis. Pneumonia, 2018, 10(1): 4.

[3] World Health Organization. Global tuberculosis report 2018. Geneva: World Health Organization, 2018.

[4] Gupta S, Kakkar V. Recent technological advancements in tuberculosis diagnostics - a review. Biosens Bioelectron, 2018, 115: 14–29.

[5] Singhania A, Wilkinson WJ, Rodrigue M, et al. The value of transcriptomics in advancing knowledge of the immune response and diagnosis in tuberculosis. Nat Immunol, 2018, 19(11): 1159–1168.

[6] Cohn DL, O’Brien RJ, Geiter LJ, et al. Targeted tuberculin testing and treatment of latentinfection. MMWR Morb Mortal Wkly Rep, 2000, 49(6): 1–54.

[7] Bosshard V, Roux-Lombard P, Perneger T, et al. Do results of the T-SPOT.interferon-γ release assay change after treatment of tuberculosis? Respir Med, 2009, 103(1): 30–34.

[8] Cole ST, Barrell BG. Analysis of the genome ofH37Rv. Novartis Found Symp, 1998, 217: 160–172.

[9] Cole ST, Brosch R, Parkhill J, et al. Deciphering the biology offrom the complete genome sequence. Nature, 1998, 393(6685): 537–544.

[10] Camus JC, Pryor MJ, Médigue C, et al. Re-annotation of the genome sequence ofH37Rv. Microbiology, 2002, 148(10): 2967–2973.

[11] Brent MR. Steady progress and recent breakthroughs in the accuracy of automated genome annotation. Nat Rev Genet, 2008, 9(1): 62–73.

[12] Goymer P. Genomics: annotating with proteomes. Nat Rev Genet, 2008, 9(6): 418.

[13] de Souza GA, M?len H, S?fteland T, et al. High accuracy mass spectrometry analysis as a tool to verify and improve gene annotation usingas an example. BMC Genomics, 2008, 9: 316.

[14] Rison SCG, Mattow J, Jungblut PR, et al. Experimental determination of translational starts using peptide mass mapping and tandem mass spectrometry within the proteome of. Microbiology, 2007, 153(2): 521–528.

[15] Schubert OT, Mouritsen J, Ludwig C, et al. The Mtb proteome library: a resource of assays to quantify the complete proteome of. Cell Host Microbe, 2013, 13(5): 602–612.

[16] Castellana N, Bafna V. Proteogenomics to discover the full coding content of genomes: a computational perspective. J Proteomics, 2010, 73(11): 2124–2135.

[17] Zhang CP, Xu P, Zhu YP. Progress in proteogenomics of prokaryotes. Chin J Biotech, 2014, 30(7): 1026–1035 (in Chinese).張成普, 徐平, 朱云平. 原核生物蛋白質基因組學研究進展. 生物工程學報, 2014, 30(7): 1026–1035.

[18] Aivaliotis M, Gevaert K, Falb M, et al. Large-scale identification of N-terminal peptides in the halophilic archaeaand. J Proteome Res, 2007, 6(6): 2195–2204.

[19] Renuse S, Chaerkady R, Pandey A. Proteogenomics. Proteomics, 2011, 11(4): 620–630.

[20] Kelkar DS, Kumar D, Kumar P, et al. Proteogenomic analysis ofby high resolution mass spectrometry. Mol Cell Proteomics, 2011, 10(12): M111.011627.

[21] Domon B, Aebersold R. Mass spectrometry and protein analysis. Science, 2006, 312(5771): 212–217.

[22] Wu FL, Zhao MZ, Zhang Y, et al. Recombinant acetylated trypsin demonstrates superior stability and higher activity than commercial products in quantitative proteomics studies. Rapid Commun Mass Spectrom, 2016, 30(8): 1059–1066.

[23] Zhao MZ, Wu FL, Xu P. Development of a rapid high-efficiency scalable process for acetylatedcationic trypsin production frominclusion bodies. Protein Expr Purif, 2015, 116: 120–126.

[24] He CT, Jia CX, Zhang Y, et al. Enrichment-based proteogenomics identifies microproteins, missing proteins, and novel smORFs in. J Proteome Res, 2018, 17(7): 2335–2344.

[25] Chi H, Liu C, Yang H, et al. Comprehensive identification of peptides in tandem mass spectra using an efficient open search engine. Nat Biotechnol, 2018, 36 (11):1059–1061.

[26] Sch?gger S. Tricine-SDS-PAGE. Nat Protac, 2006, 1(1): 16–22.

[27] Luo WJ, Deng C, Li YC, et al. Soluble expression of Tandem Hybrid Ubiquitin-binding Domains (ThUBD) in prokaryotic cytoplasm ofBL21(DE3). Mil Med Sci, 2016, 40(10): 795–800 (in Chinese).羅維佳, 鄧晨, 李衍常, 等. 串聯(lián)雜種泛素結合結構域蛋白(ThUBD)在大腸桿菌中的可溶性高效表達. 軍事醫(yī)學, 2016, 40(10): 795–800.

[28] Piubelli L, Campa M, Temporini C, et al. Optimizingas a protein expression platform to produceimmunogenic proteins. Microb Cell Fact, 2013, 12: 115.

[29] Andersson SGE, Sharp PM. Codon usage in thecomplex. Microbiology, 1996, 142(4): 915–925.

[30] Ayyar BV, Arora S, Ravi SS. Optimizing antibody expression: the nuts and bolts. Methods, 2017, 116: 51–62.

[31] Kaur J, Kumar A, Kaur J. Strategies for optimization of heterologous protein expression in.: roadblocks and reinforcements. Int J Biol Macromol, 2018, 106: 803–822.

[32] Papaneophytou CP, Kontopidis G. Statistical approaches to maximize recombinant protein expression in: a general review. Protein Expr Purif, 2014, 94: 22–32.

[33] Zhao XY, Li GS, Liang SF. Several affinity tags commonly used in chromatographic purification. J Anal Methods Chem, 2013, 2013: 581093.

[34] Hammarstr?m M, Hellgren N, van den Berg S, et al. Rapid screening for improved solubility of small human proteins produced as fusion proteins in. Protein Sci, 2002, 11(2): 313–321.

[35] Rosano GL, Ceccarelli EA. Recombinant protein expression in: advances and challenges. Front Microbiol, 2014, 5: 172.

[36] Kapust RB, Waugh DS.maltose-binding protein is uncommonly effective at promoting the solubility of polypeptides to which it is fused. Protein Sci, 1999, 8(8): 1668–1674.

[37] Hammarstr?m M, Woestenenk EA, Hellgren N, et al. Effect of N-terminal solubility enhancing fusion proteins on yield of purified target protein. J Struct Funct Genomics, 2006, 7(1): 1–14.

[38] Costa SJ, Almeida A, Castro A, et al. The novel Fh8 and H fusion partners for soluble protein expression in: a comparison with the traditional gene fusion technology. Applied microbiology and biotechnology, 2013, 97(15): 6779-6791.

[39] Kosobokova EN, Skrypnik KA, Kosorukov VS. Overview of fusion tags for recombinant proteins. Biochemistry (Moscow), 2016, 81(3): 187–200.

[40] Arnau J, Lauritzen C, Petersen GE, et al. Current strategies for the use of affinity tags and tag removal for the purification of recombinant proteins. Protein Expr Purif, 2006, 48(1): 1–13.

[41] Amann E, Brosius J, Ptashne M. Vectors bearing a hybrid-promoter useful for regulated expression of cloned genes in. Gene, 1983, 25(2/3): 167–178.

[42] Sambrook J, Russell DW. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3rd ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001: 1218–1219.

[43] Zhang K, Fu Y, Zeng WF, et al. A note on the false discovery rate of novel peptides in proteogenomics. Bioinformatics, 2015, 31(20): 3249–3253.

[44] Itkonen JM, Urtti A, Bird LE, et al. Codon optimization and factorial screening for enhanced soluble expression of human ciliary neurotrophic factor in. BMC Biotechnol, 2014, 14: 92.

Cloning, expression and purification of novel geneinH37Rv

Jialing Zhao1,3, Shujia Wu2,3, Hong Wang3,4, Qianlin Li4, Jinshuai Sun3,5, Lei Chang3, Erhei Dai4, Junzhu Wu2,Yao Zhang3,6, and Ping Xu1,3

1 School of Pharmaceutical Sciences, Wuhan University, Wuhan 430000, Hubei, China 2 School of Basic Medical Sciences, Wuhan University, Wuhan 430000, Hubei, China 3State Key Laboratory of Proteomics, Beijing Proteome Research Center, National Center for Protein Sciences (Beijing), Beijing Institute of Lifeomics, Beijing 102206, China 4 School of Public Health and Affiliated Shijiazhuang Fifth Hospital, North China University of Science and Technology, Tangshan063210, Hebei, China 5 School of Life Sciences, Hebei University, Baoding 071000, Hebei, China 6 School of Life Sciences, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510275, Guangdong, China

is a novel gene identified fromH37Rv by the proteogenomics strategy. The aim of this study was to establish a system of soluble expression and purification of the missing protein Rv2742 inH37Rv, to provide reference for further research on the biological function of. The soluble protein was not successfully induced by prokaryotic expression vectors pGEX-4T-2-, pET-32a-, pET-28a-and pMAL-c2X-. After the codon of novel genewas optimized according to.codon usage frequency, only the recombinant strain containing plasmid pMAL-c2X-could produce soluble products ofencoding gene. In addition, the expression effects of the desired fusion protein were also analyzed under different conditions including hosts, culture temperatures and IPTG concentrations. The optimum expression conditions were as follows:(DE3) host, 16 °C culture temperature and 0.5 mmol/L IPTG. After being purified by affinity chromatography with amylose resin, the fusion protein sequence was confirmed by LC-MS/MS. These results indicated that the novel geneproduct could be successfully induced and expressed in a soluble form by the expression system pMAL-c2X with MBP tag. Our findings provide reference for studies on potential interaction and immunogenicity.

,novel gene, prokaryotic expression, affinity purification

March 12, 2019;

June 14, 2019

Chinese National Basic Research Programs (No. 2017YFC0906600), National Megaprojects for Key Infectious Diseases (No. 2018ZX10302302001003), National Natural Science Foundation of China (Nos. 31670834, 31870824, 91839302), Applied and basic research foundation of Guangdong Province (No. 2018A030310257).

s: Ping Xu. Tel: +86-10-61777113; Fax: +86-10-61777050; E-mail: xupingghy@gmail.com

Yao Zhang. Tel: +86-10-61777113; Fax: +86-10-61777050; E-mail: zhangyaowsw@163.com

趙加玲, 武舒佳, 王紅, 等. 結核分枝桿菌H37Rv新基因克隆表達及純化. 生物工程學報, 2019, 35(9): 1771–1786.

Zhao JL, Wu SJ, Wang H, et al. Cloning, expression and purification of novel geneinH37Rv. Chin J Biotech, 2019, 35(9): 1771–1786.

國家精準醫(yī)學重大專項 (No. 2017YFC0906600)，國家傳染病重大專項 (No. 2018ZX10302302001003)，國家自然科學基金 (Nos. 31670834，31870824，91839302)，廣東省基礎及應用基礎研究博士科研啟動項目(No. 2018A030310257) 資助。

(本文責編 郝麗芳)