甲殼素酶Chisb的定向進化及生物轉化合成幾丁寡糖

潘夢妍，徐顯皓，劉延峰，李江華，呂雪芹，堵國成，劉龍

甲殼素酶Chisb的定向進化及生物轉化合成幾丁寡糖

潘夢妍1,2，徐顯皓1,2，劉延峰1,2，李江華1,2，呂雪芹1,2，堵國成1,2，劉龍1,2

1 江南大學 工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122 2 江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫 214122

甲殼素酶具有廣泛的工業應用前景，如可將蝦殼、蟹殼和其他甲殼廢物降解成以幾丁寡糖為主的高附加值產品，但野生型甲殼素酶催化效率低，大大限制了幾丁寡糖的生產。筆者在前期研究中表達了一個具有較高效催化效率的甲殼素酶Chisb，并對其酶學性質進行了初步研究。為進一步提高甲殼素酶Chisb的催化效率，以R13NprB-C-SP-H為親本，采用易錯PCR(Error-prone PCR)技術構建隨機突變體文庫，對甲殼素酶Chisb進行定向進化。經過96孔板初篩和搖瓶復篩，獲得了兩個催化效率進一步提高的突變體C43D和E336R。對突變體的酶學性質進行分析，C43D和E336R的最適催化溫度為55 ℃，C43D的最適pH為5.0，E336R的最適pH為9.0；其催化效率相比對照分別提高了1.35倍和1.57倍；而E336R和C43D催化產幾丁寡糖的含量分別為2.53 g/L和2.06 g/L，相比對照(0.89 g/L)分別提高了2.84倍和2.31倍；底物轉化率分別為84.3%和68.7%，相比對照(29.7%)分別提高了54.6%和39%。研究表明，通過易錯PCR引入隨機突變的方法能夠有效提高甲殼素酶Chisb的催化效率。上述研究獲得的催化效率提高的正向突變體及其酶學性質分析對生物轉化合成幾丁寡糖具有重要研究意義和應用價值。

甲殼素酶Chisb，幾丁寡糖，催化效率，易錯PCR，定向進化

甲殼素酶 (EC 3.2.1.14) 來源廣泛，存在于各種細菌、真菌和一些高等植物的組織中[1-2]。目前，甲殼素酶多應用于生物防治植物病蟲害和降解甲殼素產幾丁寡糖等方面。近年來，越來越多的國內外研究學者致力于研究甲殼素酶，但是野生型的菌株甲殼素酶產量低、活性也低，從而限制了甲殼素酶的實際應用[3]。因此，運用基因工程或酶工程等手段將甲殼素酶進行克隆表達、分子改造以提高甲殼素酶的催化活性，已經成為研究熱點。

Huang等[4]成功在大腸桿菌中高效表達了來源于蠟樣芽孢桿菌的甲殼素酶基因和，重組的甲殼素酶ChiCH和ChiCW通過GST融合標簽進行純化，純化后的蛋白比酶活分別為7.48 U/mg和3.69 U/mg。隨后又對純化后的蛋白進行了生物化學特性的鑒定，結果發現ChiCH為外切甲殼素酶，ChiCW為內切甲殼素酶。2017年，Guo等[5]從來源于類芽孢桿菌屬CS0611的菌株中分離純化了一種堿性甲殼素酶，純化后比酶活達到10.28 U/mg，經過HPLC檢測其水解產物發現，該酶可以將膠體甲殼素水解為甲殼二糖。2018年，Zhang等[6]從梅園幾丁質分解細菌SYBC-H1中表達了一種新型甲殼素酶CmChi1，經鑒定屬于糖苷水解酶18家族，通過膠體甲殼素親和層析純化后比酶活達到15.3 U/mg。CmChi1能水解膠體甲殼素且最終產物為GlcNAc，得率接近100%，產物分離后純度達到98%。

此外，還有學者通過分子對接、定點突變等技術手段對甲殼素酶的結構進行了研究。Madhuprakash等[7]對來源于變形斑沙雷氏菌的甲殼素酶D的結構進行研究，結果表明，該酶同時具有水解活性和轉糖基活性，且該酶具有糖苷水解酶18家族的特點，在其催化結構域中存在保守區域DXDXE結構，這是首次發現單個結構域的甲殼素酶同時具有兩種活性。Fan等[8]通過對來源于舞毒蛾的甲殼素酶進行定點突變，并對其活性殘基進行了功能分析。結果發現，野生型的酶比突變酶具有更高的催化效率，雖然突變位點都為負突變，但是證明了D143、D145和W146為該酶的關鍵活性位點。

我們在前期研究中，通過信號肽篩選、核糖體結合位點 (RBS) 優化和定點突變等手段，獲得了一個具有較高催化能力的甲殼素酶Chisb，其比酶活達到249.62 U/mg。研究其酶學性質發現，該酶的最適pH為5.0，最適溫度為60 ℃，m和cat/m分別為2.24 mmol/L和3.9 mmol/(L·s)。通過離子色譜檢測其水解產物發現，以膠體甲殼素為底物，該酶最終可水解得到4種不同聚合度的幾丁寡糖[9]。

如前所述，研究者已經運用多種手段對甲殼素酶進行了研究。但運用易錯PCR[10]或DNA改組[11-12]的方式對甲殼素酶分子進行定向改造的研究較少。易錯PCR是利用DNA多聚酶不具有3′→5′校對功能的特性，在一定條件下 (如不同的dNTPs濃度、Mg2+濃度和MnCl2存在) 能夠按較高的機率引入隨機突變的一種技術。本研究旨在前期研究基礎上，采用易錯PCR技術將隨機突變引入來源于芽孢桿菌屬sp. DAU101的甲殼素酶Chisb，經過96孔板初篩和搖瓶復篩，獲得催化效率進一步提高的突變體，為實現其在高效生物轉化合成幾丁寡糖中的應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株與質粒

大腸桿菌JM109、枯草芽孢桿菌WB600和重組菌株R13NprB-C-SP-H[9]均為本實驗室保藏；質粒pP43NMK_R13NprB--sp-his[9]為本實驗室構建；質粒pP43NMK_MR13NprB--sp-his為本研究中構建。

1.2 試劑與培養基

試劑：可調式易錯PCR試劑盒 (CAT#: 160903-100，北京天恩澤基因科技有限公司)；幾丁寡糖標準品 (聚合度1–5) 購自上海甄準生物科技有限公司；甲殼素粉末 (C7170，SIGMA-ALDRICH)；改良型Bradford法蛋白濃度測定試劑盒 (生工生物工程 (上海) 股份有限公司)；NuPAGE?Novex?Bis-Tris預制凝膠及標準蛋白Marker (Thermo Fisher scientific)；氨芐青霉素 (CAS 69-52-3) 和卡那霉素 (CAS 25389-94-0) 購自生工生物工程 (上海) 股份有限公司；其他常用試劑均為分析純。

培養基：種子培養基 (Luria-Bertani，LB)：酵母粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L。固體培養基添加2%的瓊脂粉。

發酵培養基 (Terrific-Broth，TB)：酵母粉24 g/L，蛋白胨12 g/L，甘油4 mL/L，K2HPO472 mmol/L，KH2PO417 mmol/L。

1.3 易錯PCR擴增chisb基因片段

以質粒pP43NMK_R13NprB--sp-his為模板，擴增片段，所用引物如表1所示。易錯PCR反應體系 (30 μL)：DNA聚合酶 (5 U/mL) 1 μL，10×易錯PCR Mix 3 μL，10×dNTPs 3 μL，MnCl24 μL，dGTP 4 μL，易錯PCR引物各1 μL，DNA模板1 μL，超純水12 μL。用1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產物，并使用膠回收試劑盒回收PCR產物。反應條件：94 ℃ 3min；94 ℃ 1 min，45 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，重復30個循環；72 ℃ 5 min。

表1 易錯PCR引物

1.4 突變文庫的構建

使用表1中P43-F和P43-R引物進行線性化擴增質粒pP43NMK_R13NprB--sp-his。用1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產物，并使用膠回收試劑盒回收PCR產物。回收的片段1、2和載體pP43NMK采用一步克隆試劑盒 (ClonExpress?II，Vazyme Biotech Co.，Ltd) 連接，構建突變重組質粒pP43NMK_MR13NprB-- sp-his。

1.5 重組質粒轉化與平板菌落PCR鑒定

將突變的重組質粒轉化至JM109中，涂布氨芐青霉素抗性平板，于37 ℃培養8–12 h。待平板長出菌落后，隨機挑選單菌落進行平板菌落PCR，驗證轉化子的陽性克隆概率。

1.6 96孔板初篩與搖瓶復篩

將平板上的菌落接種到LB液體培養基中培養一段時間，提取質粒，轉化至WB600中，涂布卡那霉素抗性平板，37 ℃培養12 h。待平板長出菌落后，首先將單菌落接種至96孔板中，用LB培養基進行種子培養，8 h后轉接至TB培養基發酵培養12 h后測定酶活大小。

將初篩得到的正向突變體進行搖瓶復篩，培養方法與初篩一致。將復篩得到的正向突變體送至蘇州金唯智有限公司進行測序，確定突變位點。

1.7 突變體活性與蛋白濃度的測定

以膠體甲殼素作為底物測定酶活大小。500 μL反應體系包含66 μL 10%的膠體甲殼素、334 μL 磷酸氫二鈉-檸檬酸鹽緩沖液 (pH 5.0) 和純化的突變體的反應混合物在60 ℃振蕩15 min后，100 ℃加熱5 min終止反應，14 000 r/min離心5 min[9]。使用改進的3,5-二硝基水楊酸 (DNS) 法在540 nm處測定上清液中還原糖的量[13]。一個單位的甲殼素酶酶活定義為在60 ℃、pH 5.0的條件下，每小時釋放1 μmol還原糖所需的酶量。用GlcNAc測定標準曲線，加熱滅活的酶作為對照。使用Bradford蛋白含量測定試劑盒 (Sangon Biotech Co.，Ltd)[14]，以牛血清白蛋白為標準對蛋白質含量進行測定。

1.8 突變體純化與酶學性質研究

1.8.1 突變體純化

將發酵液于4 ℃、12 000 r/min離心30 min，收集上清液。上清液通過0.45 μm濾膜除去雜質，以0.1 mL/min的流速直接上樣至His GraviTrap柱 (GE Healthcare，Tokyo)。上樣后，用緩沖液A (40 mmol/L Tris-HCl，150 mmol/L NaCl，pH 7.5) 平衡柱子，流速為0.2 mL/min。然后用緩沖液B (40 mmol/L Tris-HCl，150 mmol/L NaCl，500 mmol/L咪唑，pH 7.5) 從5%–100%進行梯度洗脫，流速為0.2 mL/min，最后使用HiTrapTMDesalting脫鹽柱進行脫鹽，純化后的酶液保存在4 ℃以備使用。純化的蛋白用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳 (SDS-PAGE)[15]進行檢測。

1.8.2 突變體酶學性質研究

為測定溫度對突變體酶活性的影響，根據1.7中突變體酶活的測定方法，測定25 ℃–70 ℃等溫度下，突變體的酶活，確定其最適反應溫度。

為測定pH對突變體酶活性的影響，根據1.7中突變體酶活的測定方法，選擇pH 3.0–12.0的各種緩沖液測定突變體的最適反應pH。使用的緩沖液如下：磷酸氫二鈉-檸檬酸鹽緩沖液 (pH 3.0–6.0)，磷酸氫二鉀-磷酸二氫鉀緩沖液 (pH 6.0–9.0)，甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液 (pH 9.0–12.0)。使用的所有緩沖液濃度均為20 mmol/L。

為測定不同金屬離子對突變體酶活性的影響，分別用1、5和10 mmol/L的CoCl2、MnCl2、MgCl2、FeCl3、CuCl2、ZnCl2、CaCl2、KCl、AlCl3、BaCl2、NiSO4、C2H3O2Li等金屬離子的鹽溶液在標準酶活測定條件下反應，以不加金屬離子的反應為對照，研究金屬離子對突變體酶活的影響。

以不同濃度的膠體甲殼素為底物，測定突變體的動力學參數。使用Matlab軟件擬合曲線，計算米氏常數 (m) 和最大反應速率 (max)，進而推導出特征常數cat和催化效率比cat/m。

以上所有實驗均進行3次，并取平均值和方差進行計算。

1.9 高效液相色譜 (HPLC) 分析水解產物

收集12 h的對照菌株與突變體的發酵上清液，在3 g/L的底物終濃度下分別于55 ℃反應2、4、6、8、10、12、20、24 h。14 000 r/min離心10 min水解后的反應液，上清液用于HPLC分析 (Agilent 1260 system，USA)。色譜柱：Shodex Asahipak NH2P-50 4E柱 (4.6 mm×250 mm)，流動相：乙腈∶水=70∶30；流速是0.6 mL/min，檢測器用紫外檢測器 (VWD)，波長210 nm，進樣量10 μL，柱溫30 ℃。

2 結果與分析

2.1 易錯PCR擴增結果

使用表1的引物擴增片段1和2，基因全長1 692 bp，分為兩段進行擴增。1片段長767 bp，2片段長925 bp，擴增結果如圖1所示。擴增1片段的3對引物中，只有chisb1-F1/R1能擴增出目的條帶，其余2對引物擴增都沒有明顯條帶；而用引物chisb2- F2/R2擴增2片段的效果沒有chisb2-F1/R1和chisb2-F3/R3引物的擴增效果好。所以選用引物chisb1-F1/R1擴增1片段，引物chisb2- F1/R1擴增2片段，引入隨機突變位點。

圖1 chisb1和chisb2的凝膠電泳圖

2.2 突變文庫的構建及平板鑒定

引物P43-F和P43-R擴增得到的線性化質粒與回收的1和2片段采用一步克隆試劑盒進行連接，轉化JM109，可在氨芐平板上得到約1 000個單菌落，隨機挑選100個單菌落進行PCR驗證，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測條帶大小，結果顯示全部為陽性克隆。隨機挑選8個單菌落的驗證條帶如圖2所示。可以看出，片段已成功轉入JM109中。將平板上的單菌落接種于LB液體培養基進行培養，然后提取重組質粒，轉化至WB600，在卡那霉素平板上長出約700個陽性克隆。

2.3 96孔板初篩與搖瓶復篩結果

將卡那霉素平板上長出的約700個陽性克隆接種于含LB液體培養基的96孔板中，培養8 h后，再轉接至TB發酵培養基中培養12 h，12 000 r/min離心10 min后取上清液進行酶活測定。結果顯示，其中24株突變體的酶活高于對照。將這24株突變體進行搖瓶復篩鑒定，采用同樣的方法進行培養和酶活測定，其中2株突變體的活力顯著高于其他突變體。經過序列比對發現，分別是第43位半胱氨酸突變為天冬氨酸 (C43D) 和第336位谷氨酸突變為精氨酸 (E336R)。

圖2 基因chisb的凝膠電泳圖

2.4 突變體的純化

為了進一步研究突變體的酶學性質，將搖瓶復篩得到的2個突變體進行了鎳柱純化。結果如圖3和表2所示。由圖3可以看出，突變體C43D和E336R經過鎳柱純化后完全被10%的B液洗脫，在62 kDa處得到一條單一的條帶。由表2可見，經過鎳柱純化后的突變體酶與粗酶相比，比酶活都得到了提高，突變體C43D和E336R的純化倍數分別是之前的3.05倍和3.69倍，得率分別為80.77%和85.45%。

圖3 突變體的SDS-PAGE分析

2.5 突變體的酶學性質研究

由圖4A可以看出，突變體C43D和E336R的最適溫度都為55 ℃，當溫度高于55 ℃，突變體活性迅速降低。圖4B顯示了突變體C43D的最適pH為5.0，pH大于5.0，突變體活性緩慢下降；而E336R的最適pH為9.0，當pH在3.0–6.0之間時，E336R的活性呈上升趨勢，pH高于6.0活性下降，但在9.0時活性顯著上升，pH高于9.0又迅速下降。

通過測定金屬離子對突變體酶活的影響 (如圖5所示)，發現15 mmol/L的Mn2+對兩株突變體的活性具有顯著的促進作用，高濃度的Ba2+對突變體的活性也有促進作用。而Ni+、Mg2+、Ca2+和K+對突變體C43D的活性影響不大，但無論是高濃度還是低濃度的Fe3+、Cu2+和Al3+都對C43D突變體活性具有抑制作用；與C43D突變株一樣，Fe3+、Cu2+和Al3+也會抑制E336R的活性。除此之外，高濃度的Zn2+也會抑制其活性。

以膠體甲殼素作為底物，對兩個突變體的動力學參數也進行了測定。軟件擬合曲線如圖6所示，計算結果如表3所示。實驗發現，與對照相比，突變體C43D和E336R的m值降低，說明底物親和力增加；催化常數cat升高，催化效率cat/m相比對照分別提高了1.35倍和1.57倍。

2.6 水解產物的HPLC分析

結果如圖7所示。由圖7A可以看出，對照 (原始酶) 水解膠體甲殼素生成的幾丁寡糖總量為0.89 g/L，底物轉化率為29.7%，水解產物以(GlcNAc)2為主。而突變體E336R水解膠體甲殼素產生的幾丁寡糖總量始終高于C43D突變體，其催化24 h后幾丁寡糖總量達到最大，分別為2.53 g/L和2.06 g/L，轉化率分別為84.3%和68.7% (圖7B，7C)。進一步分析發現，突變體的催化水解產物都為GlcNAc、(GlcNAc)2、(GlcNAc)3和(GlcNAc)5，但是反應8 h之后，檢測不到 (GlcNAc)3的生成。其中 (GlcNAc)2含量最高，反應至24 h時，C43D和E336R突變體生成的 (GlcNAc)2分別占總糖含量的71.8%和57.7%。

表2 突變體的純化結果

表3 突變體的動力學參數

3 討論

甲殼素酶在農業、醫藥和生物防治方面具有廣泛的應用。但是野生菌產的甲殼素酶活性較低，對于工業化生產甲殼素酶有一定差距[16]。隨著對甲殼素酶研究的深入，研究者多采用在大腸桿菌和畢赤酵母中進行異源表達的方式生產甲殼素酶[17-19]。除此之外，還對甲殼素酶的特性和結構進行了細致的研究。

目前，運用易錯PCR和定點突變技術是對甲殼素酶進行改造的有效方式[20-21]。易錯PCR是一種使復制的DNA序列出現錯誤的一種PCR技術，它通過保真度低的DNA聚合酶，使DNA復制的保真度降低，從而在合成的新鏈中增加錯配的堿基，達到產物出現多個點突變的效果[22]。而運用易錯PCR對甲殼素酶進行定向進化，可能成為一種提高甲殼素酶催化活性的有效方式。本研究中，以前期獲得的產甲殼素酶的重組菌R13NprB-C-SP-H為出發菌株，利用隨機突變和高通量篩選的方法獲得了底物親和力、催化效率和比活性都明顯提高的甲殼素酶突變體C43D和E336R。

通過對兩種甲殼素酶突變體的酶學性質進行測定發現，突變體的最適溫度 (55 ℃) 相比未突變的酶 (60 ℃) 要低，突變體在60 ℃時，活性顯著降低，這可能是位于甲殼素酶催化結構域附近的天冬氨酸，其羧基在高溫下不穩定而半胱氨酸的巰基更加穩定導致的。比較最適pH發現，C43D突變體沒有發生變化，E336R突變體的最適pH為9.0，造成這一現象的原因其一可能是：由于336位的谷氨酸為酸性氨基酸，帶負電荷，當突變為精氨酸后，精氨酸為堿性氨基酸，突變后原本結構中的酸性基團變為堿性基團，在pH為9.0的緩沖溶液中，蛋白帶正電荷，在堿性環境下更穩定；其二是由于突變為Arg之后，Arg與周圍相鄰的其他氨基酸形成了新的氫鍵網絡和鹽橋結構，導致突變體的pH發生改變[23-24]。而C43D突變體中的天冬氨酸為酸性氨基酸，帶負電荷，它會影響斷裂位點周圍電離基團的pKa值，在原本酸性的環境下，使得突變體C43D的最適pH保持不變[25]。除此之外，天冬氨酸在甲殼素酶的催化反應中還參與配體的催化和結合。2012年，Suginta等[26]報道了來源于哈氏弧菌的甲殼素酶A，其催化結構域附近的Asp313的羧基可以與-乙酰基團中的-C=O (羰基) 相互作用，從而使得生成的產物構像發生改變。本研究中43位的半胱氨酸位于甲殼素酶Chisb的催化結構域附近，當突變為天冬氨酸，其羧基可以與底物乙酰基團中的羰基發生相互作用，而半胱氨酸的巰基與羰基的相互作用較弱，因此突變后底物親和力增加，說明催化結構域附近的天冬氨酸在甲殼素酶的底物結合中具有重要作用[27]。

當以膠體甲殼素作為底物對突變體的動力學參數進行測定，我們發現，相比未突變酶的米氏常數 (m) 為2.24 mmol/L，突變體C43D和E336R的m值降低，說明突變體對底物的親和力增加；特別是突變體E336R，由于精氨酸結構中的側鏈比谷氨酸的側鏈長，會導致底物的結合口袋變大，增加了酶與底物的結合能力，更多的底物會進入到底物結合口袋，因此底物親和力顯著增加；另外，精氨酸結構中所含有的陽離子不會阻礙底物結合，底物可以自由進入到底物結合口袋，使底物親和力增加。同時，突變體的催化效率 (cat/m) 相比未突變的酶的催化效率 (3.9 L/(s·mmol)，也分別提高了1.35倍和1.57倍。分析甲殼素酶Chisb的三維蛋白結構[9,28]，C43D突變體中的天冬氨酸，它可以和幾丁寡糖分子中 (?1) 位的非還原性糖基結合形成氫鍵，穩定甲殼素酶的催化活性；而E336R突變體中的精氨酸與甲殼素酶Chisb周圍相鄰的氨基酸形成了新的鹽橋，從而提高了催化效率[29-30]。

綜上所述，我們的研究證明了隨機突變結合高通量篩選技術是提高甲殼素酶催化效率及其底物親和力的一種有效手段，這為利用甲殼素酶高效生物轉化合成幾丁寡糖奠定了一定基礎。

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Directed evolution of chitinase Chisb and biosynthesis of chitooligosaccharides

Mengyan Pan1,2, Xianhao Xu1,2, Yanfeng Liu1,2, Jianghua Li1,2, Xueqin Lü1,2, Guocheng Du1,2, and Long Liu1,2

1 Key Laboratory of Industrial Biotechnology,Ministry of Education,Jiangnan University,Wuxi 214122,Jiangsu,China 2 College of Bioengineering, Jiangnan University,Wuxi214122,Jiangsu,China

Chitinase has a wide industrial application prospect. For example, it can degrade shrimp shells, crab shells and other crustacean waste into high value-added chitooligosaccharides. However, the low catalytic efficiency of chitinase greatly limits the production of chitooligosaccharides. In previous study, the we expressed a chitinase Chisb with high catalytic efficiency and studied its enzymatic properties. In order to further improve the catalytic efficiency of Chisb, with R13NprB-C-SP-H as the parent, here error-prone PCR was used to construct random mutant library to conduct directed evolution of chitinase Chisb. Two mutants C43D and E336R were obtained with 96-well plate primary screening and shaker-screening, and their enzymatic properties were also studied. The optimum temperature of C43D and E336R was 55 °C, and the optimum pH of C43D was 5.0, while that of E336R was 9.0. The catalytic efficiency of C43D and E336R was 1.35 times and 1.57 times higher than that of control. The chitooligosaccharide concentration of E336R and C43D was 2.53 g/L and 2.06 g/L, improved by 2.84 times and 2.31 times compared with the control (0.89 g/L), respectively. In addition, the substrate conversion rate of mutants E336R and C43D was 84.3% and 68.7%, improved by 54.6% and 39% compared with the control (29.7%), respectively. In summary, the study indicates that random mutation introduced by error-prone PCR can effectively improve the catalytic efficiency of chitinase Chisb. The positive mutants with higher catalytic efficiency obtained in the above study and their enzymatic property analysis have important research significance and application value for the biosynthesis of chitooligosaccharides.

chitinase Chisb,chitooligosaccharides, catalytic efficiency, error-prone PCR, directed evolution

February 20, 2019;

April 2, 2019

National Natural Science Foundation of China (Nos. 31622001, 21808084).

Long Liu. Tel: +86-510-85918312; Fax: +86-510-85918309; E-mail: longliu@jiangnan.edu.cn

國家自然科學基金 (Nos. 31622001，21808084) 資助。

2019-04-25

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.q.20190424.1452.002.html

潘夢妍, 徐顯皓, 劉延峰, 等. 甲殼素酶Chisb的定向進化及生物轉化合成幾丁寡糖. 生物工程學報, 2019, 35(9): 1787–1796.

Pan MY, Xu XH, Liu YF, et al. Directed evolution of chitinase Chisb and biosynthesis of chitooligosaccharides. Chin J Biotech, 2019, 35(9): 1787–1796.

(本文責編 陳宏宇)