人IL-35單克隆抗體制備及其在定量ELISA檢測方法中的應用

何峰容，孫穎，樂鑫，劉勇，劉夢元,3

人IL-35單克隆抗體制備及其在定量ELISA檢測方法中的應用

何峰容1,2，孫穎2，樂鑫2，劉勇2，劉夢元1,2,3

1 湖北大學 生命科學學院 生物催化與酶工程國家重點實驗室，湖北 武漢 430062 2 武漢云克隆科技股份有限公司，湖北 武漢 4 30056 3 藥物高通量篩選國家與地方聯合工程研究中心，湖北 武漢 430062

為了建立人白細胞介素-35 (IL-35) 的定量ELISA檢測方法，RT-PCR 克隆了人IL-35的IL-27EBI3亞基和IL-12p35亞基的編碼基因，在大腸桿菌中實現了2個亞基的高效表達。以大腸桿菌表達的IL-27EBI3和IL-12p35重組蛋白作為免疫原，免疫BaLb/c小鼠，選取陽性血清小鼠的脾細胞與小鼠骨髓瘤SP2/0細胞融合，用間接ELISA和有限稀釋法進行單克隆雜交瘤細胞的篩選和克隆，獲得了穩定分泌抗IL-27EBI3和抗IL-12p35單克隆抗體的雜交瘤細胞株。在效價測定和特異性鑒定的基礎上，進一步篩選出一株能穩定分泌抗IL-27EBI3單克隆抗體的雜交瘤細胞株3B11和一株能穩定分泌抗IL-12p35 單克隆抗體雜交瘤細胞株3A10，亞類鑒定兩株單抗均為IgG1。應用單抗3B11和3A10建立了IL-35雙抗夾心定量ELISA檢測方法，借助生物素-親和素放大效應，該方法檢測IL-35線性范圍為3.12–200 pg/mL，最低檢測限為1.26 pg/mL，與多種其他抗原的交叉反應率為0.1%，批內相對標準偏差 (RSD) 為5.1%–5.6%，批間RSD為5.6%–7.2%，添加回收率為89%–103%，達到定量分析的要求，為進一步組裝IL-35定量ELISA檢測試劑盒打下了基礎。

人白細胞介素IL-35，單克隆抗體，定量ELISA，試劑盒

白細胞介素IL-35是最新發現的IL-12細胞因子家族的成員，是由IL-12家族α鏈p35 (IL-12p35)和一個β鏈EBI3組成的異源二聚體蛋白[1]。p35亞基在人體內廣泛組成型表達，可與p40組成IL-12。EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV) 誘導基因3 (EBI3) 是IL-12的p40亞基同源物，最初在被EB病毒感染的B細胞中發現，可與IL-12家族的p28組成IL-27，因而也稱為IL-27EBI3。IL-35由調節性T細胞 (Regulatory T cell，Treg) 分泌，在T細胞分化中扮演著重要的角色[2]，可刺激Treg的增殖，抑制效應性CD4+T細胞和CD8+T細胞的增殖，抑制CD4+T細胞分化為Th17效應細胞，是繼TGF-β、IL-10、IL-27之后發現的一個新型免疫抑制性細胞因子[3-4]。IL-35在腫瘤、自身免疫病和感染性疾病發揮著重要的免疫調節作用[5-9]。在腫瘤微環境中，IL-35可有效抑制T細胞對腫瘤的免疫應答，IL-35還可通過趨化髓源性抑制細胞(MDSC) 在腫瘤內聚集并促進腫瘤的血管形成，從而促進腫瘤的生長和免疫逃逸[2,10]。在自身免疫性疾病如類風濕關節炎(RA)中，IL-35通過擴增Tregs，抑制Th1和Th17效應細胞的分化和免疫應答，減少TNF-α和IL-17的分泌，有效減輕關節炎癥[11-12]。在感染性疾病中，IL-35則發揮著雙重作用，急性感染時，IL-35可明顯誘導Th1細胞清除感染，同時擴增Tregs并抑制Th17細胞分化；慢性感染時，擴增的Tregs則表現為抑制效應性CD4+T細胞，防止過度免疫損傷的發生[11]。越來越多的研究證實人血清IL-35的水平與多種疾病的發生、發展和預后相關。腫瘤患者血清中的IL-35升高而自身免疫疾病患者血清IL-35降低，提示IL-35可能成為相關疾病的診斷和監測標志物。事實上，IL-35是多種惡性腫瘤的早期診斷和預后標志物，也是多種惡性腫瘤潛在的治療靶點[13-18]。類風濕關節炎(Rheumatoid arthritis，RA)RA患者血清IL-35水平顯著低于健康人群，抗TNF-α治療可有效誘導RA患者Tregs的增殖，上調血清IL-35的水平，血清IL-35水平的變化可作為監測RA病情和評價治療效果的參考指標[19-20]。乙型肝炎病毒(HBV) 感染可顯著提升血清IL-35水平，有證據表明IL-35參與HBV導致的肝硬化形成，故IL-35水平可作為乙型肝炎疾病進展和藥物療效的重要評價指標[21-22]。這些資料表明，IL-35的定量檢測不僅對其生物學功能的基礎研究具有重要意義，而且對腫瘤、自身免疫疾病及感染性疾病的診斷、藥物療效和預后的評價同樣具有重要的意義。

IL-35是一個新發現的細胞因子，市面上針對IL-35的檢測工具很少，目前主要依賴進口。我們制備了IL-35兩個亞基IL-12p35和IL-27EBI3的重組蛋白，通過單克隆抗體雜交瘤技術獲得了針對IL-12p35和IL-27EBI3的單克隆抗體，建立了IL-35雙抗夾心定量檢測方法，并對該檢測方法的各項性能進行了綜合評價，為進一步組裝成IL-35的定量檢測試劑盒打下了基礎。

1 材料與方法

1.1 質粒，菌株和細胞株

原核表達載體pTS為本實驗構建和保存。大腸桿菌Top10 (用于分子克隆和質粒保存)，大腸桿菌BL21 star (DE3) (用于蛋白表達的宿主細胞) 均購自天根生化科技 (北京) 有限公司。SP2/0購自中國典型培養物保存中心，并由實驗室傳代保存。人臍靜脈內皮細胞 (HUEVC) 購自武漢原生原代生物科技有限公司。

1.2 試劑與動物

重組人IL-35、IL-12、IL-23、IL-27、IL-6、IL-10及TNF-α購自Peprotech公司。限制性內切酶、T4 DNA連接酶、DNA多聚酶、AMV反轉錄酶、DNA回收試劑盒、RNA提取試劑盒購自大連寶生物 (TaKaRa)。Ni-NTA親和層析凝膠、A蛋白親和層析凝膠購自Pharmacia公司。弗氏完全佐劑購自Sigma公司。單克隆抗體亞類鑒定試劑盒購自Proteintech公司。水溶性生物素化試劑N-羥基磺酸基琥珀生物素 (Sulfo-NHS-Biotin) 及親和素標記的辣根過氧化物酶 (Streptavidin-HRP) 購自Thermo Fisher Scientific。雌性Balb/c小鼠購自湖北省疾病預防控制中心，用標準的嚙齒動物飼料進行喂養，所有相關實驗動物的操作嚴格按照國家科技部發布的《實驗動物管理條例》進行。

1.3 細胞培養和RNA的提取

用含10%小牛血清的ECM培養基 (Sciencell) 37 ℃、5% CO2培養臍靜脈內皮細胞 (HUEVC)，待細胞90%匯合時，加入1 ng/mL的TNF-α，繼續培養12 h，胰酶消化，收集細胞。用RNA提取試劑盒提取HUEVC細胞總RNA，具體操作按照試劑盒說明書進行。

1.4 IL-27EBI3和IL-12p35基因的克隆

根據GenBank中IL-27EBI3已知序列(GenBank Accession No. NM_005755.2) 和IL-12p35已知序列 (GenBank Accession No. NM_000882.3) 設計擴增IL-27EBI3和IL-12p35編碼基因的引物，引物如表1所示。在PCR反應管中加入HUEVC細胞總RNA 5 μL，70 ℃作用5 min后冷卻至0 ℃，依次加入超純水9.5 μL，5×AMV緩沖液5 μL，dNTPs (10 mmol/L) 2.5 μL，RNasin 1 μL和AMV反轉錄酶1 μL，于50 ℃反轉錄60 min，95 ℃ 5 min滅活反轉錄酶。在PCR反應管中加入超純水34 μL，10×PCR緩沖液5 μL，反轉錄產物2 μL，dNTPs(10 mmol/L) 1 μL，上游引物和下游引物各1 μL，25 mmol/L MgCl225 μL，DNA聚合酶1 μL，其中P1、P2擴增IL-27EBI3編碼基因，P3、P4擴增IL-12p35編碼基因。PCR反應條件為：95 ℃ 5 min；然后95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個循環；72 ℃ 10 min，冷卻至4 ℃保存。對擴增產物及質粒pTS分別進行Ⅰ和HⅠ雙酶切，將IL-27EBI3和IL-12p35編碼基因分別連入載體pTS中，形成IL-27EBI3表達載體pTES和IL-12p35的表達載體pTPS，轉化大腸桿菌Top10，進行載體的擴增，提取質粒進行序列測定，確保基因的連接和序列正確，表達載體分別轉化大腸桿菌BL21 star (DE3)，形成穩定表達IL-27EBI3和IL-12p35的基因工程重組菌株。

表1 擴增IL-27EBI3和IL-12p35編碼序列的引物

Note: P1 and P2 are for the amplification of gene encoding IL-27EBI3, and P3 and P4 for the amplification of IL-12p35.I andH I restriction sites (Underlined) were introduced to the primers for cloning purpose. The protective bases are marked with bold.

1.5 IL-27EBI3和IL-12p35的表達與復性

將含有表達載體IL-27EBI3/pTES和含有表達載體IL-12p35/pTPS的大腸桿菌BL21 star (DE3)接種25 mL含50 μg/mL卡那霉素的LB培養基，37 ℃搖動過夜，以1∶40轉接于1 L含50 μg/mL卡那霉素的LB培養基，置于5 L搖瓶中于37 ℃搖動培養至600為0.6，加入終濃度為0.4 mmol/L的IPTG，繼續培養5 h，誘導IL-27EBI3和IL-12p35的表達。培養物于4 ℃、12 000×離心20 min，收獲菌體，重懸于超聲緩沖液中，超聲破碎菌體，12% SDS-PAGE檢測，觀察目標蛋白的表達情況。目標蛋白包涵體的變性及其在變性條件下的固定化Ni2+親和層析純化按常規方法進行，并經12% SDS-PAGE檢測。將純化的包涵體蛋白稀釋到250 μg/mL，裝入適當大小的透析袋，進行逐步移除變性劑尿素的透析復性。即對100倍體積分別含4、2、1及0 mmol/L尿素的硼酸緩沖液 (0.9% () 硼酸，0.3% () NaOH，pH 9.6) 從高到低分步透析，每個尿素濃度透析4 h，并 在含2、1、0 mmol/L尿素的硼酸緩沖液中加入0.5 mol/L L-精氨酸和GSH/GSSG (1 mmol/L/ 1 mmol/L) 作為復性添加劑。最后，蛋白置于100倍體積20 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)中透析2次，每次4 h，徹底去除殘留的尿素和其他雜質，并 通過0.22 μm的濾膜過濾除菌，超濾濃縮，凍干備用。

1.6 動物免疫

以純化的重組蛋白IL-27EBI3和IL-12p35作為免疫原，背部皮下分別注射5只6周齡雌性Balb/c小鼠，免疫前取血作為陰性血清對照。初次免疫劑量為100 μg/只，與等體積的弗氏完全佐劑混合乳化后免疫小鼠，之后每隔2周以相同劑量免疫原與等體積弗氏不完全佐劑混合乳化后免疫。第4次加強免疫2周后，從小鼠尾靜脈少量取血，經間接ELISA檢測血清抗體效價，選效價較高的小鼠于細胞融合前3天經腹腔注射免疫原100 μg加強免疫。斷頸處死小鼠，按文獻方法分離小鼠脾細胞[23]。

1.7 細胞融合及雜交瘤細胞的篩選

將增殖期的小鼠骨髓瘤細胞SP2/0和新鮮分離的免疫小鼠的脾細胞按5∶1的比例混勻，離心棄上清后加入50%的聚乙二醇進行細胞融合，然后緩慢加入RPMI-1640培養基終止反應，離心棄上清，用HAT培養基重懸細胞，鋪于96孔細胞培養板，置于37 ℃、5%的CO2培養箱中培養， 7 d后改用HT培養基繼續培養。用重組蛋白IL-27EBI3和IL-12p35作為抗原，以不含外源基因的空表達載體轉化的大腸桿菌 (BL21 star (DE3)) 裂解液作為陰性對照，采用間接ELISA對細胞培養上清進行篩選，將陽性反應孔的雜交瘤細胞進行有限稀釋克隆化培養，經多次克隆化培養，直至篩選出由單個細胞繁殖而來且ELISA反應陽性的細胞克隆。

1.8 間接ELISA

用間接ELISA方法進行血清抗體效價和雜交瘤細胞培養上清抗體效價的檢測。具體方法如下：以重組IL-27EBI3和IL-12p35作為檢測抗原，以空表達載體轉化的大腸桿菌 (BL21 star (DE3)) 裂解蛋白作為陰性對照抗原，包被96孔ELISA板，1 μg/mL， 100 μL/孔，4 ℃過夜，PBST洗板3次，5%的脫脂奶粉100 μL/孔封閉2 h，PBST洗板3次，于每孔加入倍比稀釋血清或雜交瘤細胞培養上清，每稀釋度3個復孔，37 ℃孵育1 h，PBST洗板3次，于每孔中加入100 μL羊抗鼠IgG (1∶5 000)，37 ℃孵育1 h，PBST洗板3次，于每孔中加入100 μL顯色液 (1 mmol/L OPD，0.016% H2O2)，37 ℃避光孵育10 min，加入硫酸終止反應，酶標儀讀取每孔490 nm處吸收值 (490)。

1.9 單克隆抗體的鑒定

單克隆抗體亞型的鑒定按照試劑盒說明書進行。單克隆抗體的抗原結合特異性采用Western blotting檢測，具體方法如下：將5 μg不同抗原分別點樣于0.45 μm硝酸纖維濾膜 (美國Pall Gelman)，于25 ℃靜置晾干，以重組蛋白IL-27EBI3和IL-12p35為陽性對照，以不含外源基因的空表達載體轉化的大腸桿菌 (BL21 star (DE3)) 裂解液作為陰性對照；將膜浸泡于5%的脫脂牛奶中4 ℃封閉過夜，1×PBS (pH 7.4) 洗膜3次；將膜浸泡于含1 μg/mL單克隆抗體的1×PBS (pH 7.4) 中，37 ℃孵育2 h，1×PBS洗膜3次；將膜浸泡于含HRP標記兔抗鼠IgG (1∶1 000稀釋) 的1×PBS (pH 7.4)中，37 ℃孵育1 h，1×PBS洗膜3次；加入DAB顯色劑，待顯色到理想程度，自來水沖洗終止反應。

1.10 單克隆抗體的收集與純化

對篩選出的穩定分泌目標抗體的雜交瘤細胞采用RPMI-1640完全培養基擴大培養，收集細胞培養上清，離心去除沉渣，按常規方法用Protein A柱對單抗進行純化，純化后的抗體對20 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)透析換液，超濾濃縮備用。

1.11 生物素標記抗體的制備

將待標記的抗體用0.1 mol/L的碳酸鹽緩沖液 (pH 8.0) 稀釋到1 mg/mL，于2 mL蛋白質溶液中加入Suf-NHS-Biotin，使其終濃度為120 μg/mL，于25 ℃持續攪拌24 h，向反應體系中加入9.6 μL 1 mmol/L NH4Cl，于25 ℃持續攪拌10 min，將反應體系轉入透析袋中，于4 ℃對1×PBS (pH 7.4) 透析4 h以除去游離的生物素，將樣品上Sephadex G-25凝膠層析柱，1×PBS洗脫，收集蛋白質峰，超濾濃縮備用。

1.12 雙抗夾心ELISA檢測IL-35方法的建立

建立雙抗夾心ELISA方法，即以抗IL-27EBI3的單克隆抗體作為包被抗體，捕獲樣品中的IL-35，以生物素化的抗IL-12p35單克隆抗體作為檢測抗體，加入親和素化的辣根過氧化物酶 (Streptavidin-HRP) 進行偶聯和信號放大，最后加入底物TMB顯色，測定450 nm處的吸光值(450)。首先，基于棋盤法確定最優的抗體包被濃度和生物素化抗體的工作濃度。制備抗IL-27EBI3的單克隆抗體包被量不同的3種酶聯板：1 μg/孔 (10 μg/mL，100 μL)、500 ng/孔 (5 μg/mL，100 μL)、100 ng/孔 (1 μg/mL，100 μL)。每種包被量的酶聯板中加入100 μL系列濃度的IL-35 (200 pg/mL、100 pg/mL、50 pg/mL、25 pg/mL、12.5 pg/mL、6.25 pg/mL、3.12 pg/mL)。每個濃度的IL-35檢測孔分別采用3種不同濃度的生物素化抗IL-12p35單克隆抗體 (500 ng/mL、100 ng/mL、50 ng/mL)，100 μL/孔。按常規方法進行夾心ELISA的操作，以450值≥0.2為陽性cutoff值，觀察上述不同組合方式檢測IL-35的靈敏度，確定包被抗體的最佳使用量和生物素抗體的最佳工作濃度。

1.13 定量曲線的構建

以確定的最佳用量包被抗IL-27EBI3的單克隆抗體于96孔ELISA板，每孔于100 μL 0.1 mol/L碳酸鹽緩沖液中，4 ℃過夜。PBST洗板3次，5%的脫脂奶粉100 μL/孔，37 ℃封閉2 h，PBST洗板 3次，加入100 μL /孔系列濃度的IL-35 (400 pg/mL、200 pg/mL、100 pg/mL、50 pg/mL、25 pg/mL、12.5 pg/mL、6.25 pg/mL、3.12 pg/mL、1.56 pg/mL、0 pg/mL)，37 ℃孵育2 h。PBST洗板3次，加入100 μL/孔最佳工作濃度的生物素化抗IL-12p35單克隆抗體，37 ℃孵育2 h。PBST洗板3次，加入100 μL/孔親和素化的辣根過氧化物酶 (Streptavidin-HRP)，37 ℃孵育1 h。PBST洗板 3次，加入100 μL/孔TMB顯色液，37 ℃避光孵育10 min。加入50 μL/孔2 mol/L H2SO4終止反應，酶標儀測定450 nm吸收值 (450)，每個IL-35濃度3復孔，取平均450。以450為縱坐標，IL-35濃度為橫坐標，繪制標準曲線，用GraphPad Prism進行標準曲線的擬合，確定檢測的線性范圍和定量方程。

1.14 靈敏度、特異性、精密度和準確度評價

將各種待檢細胞因子用樣品稀釋液 (1×PBS) 稀釋為1 μg/mL的標準品，蛋白定量采用Bradford法。然后根據下述實驗要求分別稀釋成相應的質控品。用上述建立的夾心ELISA方法測定20個空白樣品即樣品稀釋液 (1×PBS) 的450值，將測定的平均值加上2倍標準差所得的值代入定量方程，所得到的樣品濃度值即為該檢測方法的最低檢測下限 (靈敏度)。于7份樣品稀釋液 (1×PBS) 中分別添加重組IL-12p35、重組IL-27EBI3、IL-12、IL-23、IL-27、IL-6、IL-10，終濃度為20 pg/mL，每種待檢細胞因子3復孔，用上述建立的夾心ELISA方法分別測定上述細胞因子濃度，取平均值，特異性用交叉反應率來表示，即實際測定濃度與實際添加濃度的比值(%)。用該方法測定IL-35的高 (200 pg/mL)、中 (50 pg/mL)、低 (5 pg/mL) 3個濃度的質控品，每個質控品測定15次，分3批測定，每批測定5次，計算檢 測數據的批內相對標準偏差(Relative stardard deviation，RSD(%)) 和批間RSD(%)，評價檢 測方法的精密度 (重復性)。在含3.6 pg/mL IL-35的稀釋樣品中分別添加高、中、低濃度的IL-35，使其終濃度分別為13.6 pg/mL、43.6 pg/mL和 123.6 pg/mL，用該方法對樣品中的IL-35進行測定，每個濃度3個復孔，準確度用添加回收率表示，即實測濃度平均值減去原稀釋品濃度的差與實際添加濃度的比值(%)。

2 結果與分析

2.1 IL-27EBI3和IL-12p35的基因克隆、表達與制備

如圖1所示，RT-PCR從TNF-α刺激的人臍靜脈內細胞 (HUVEC) 擴增出IL-12p35和IL-27EBI3的編碼基因，大小分別為816 bp和759 bp。擴增產物經Ⅰ和HⅠ雙酶切克隆至原核表達載體pTS，獲得IL-27EBI3表達載體pTES和IL-12p35的表達載體pTPS (圖2A)。IL-27EBI3和IL-12p35的編碼基因在強啟動子T7的控制之下，經IPTG誘導在大腸桿菌中獲得了高效表達，SDS-PAGE顯示表達產物以包涵體的形式存在于大腸桿菌的超聲沉淀中，分子質量大約為25 kDa和29 kDa，與理論大小一致 (圖2B、2C)。在變性條件下，重組蛋白通過固定化的Ni2+親和層析一步純化可達到95%以上的純度 (圖2B、2C)。通過緩慢去除變性劑尿素的透析復性以及超濾濃縮，可以從1 L大腸桿菌培養物中獲得25–30 mg的目的蛋白，濃度可達1 mg/mL。

2.2 抗IL-27EBI3和抗IL-12p35單克隆抗體的制備和鑒定

用純化制備的重組IL-27EBI3和IL-12p35分別免疫5只雌性Balb/C小鼠，選擇其中3只血清抗體效價較高的小鼠的脾細胞與SP2/0進行細胞融合，獲得雜交瘤細胞。以重組IL-27EBI3和IL-12p35分別作為抗原，同時以空表達載體轉化的大腸桿菌 (BL21 star (DE3)) 裂解液作為陰性對照，用間接ELISA 對雜交瘤細胞培養上清進行篩選，經多輪檢測和有限稀釋法克隆3次后，獲得了3個穩定分泌抗IL-27EBI3單克隆抗體的細胞株3B11、3D07、3E10和3個穩定分泌抗IL-12p35單克隆抗體的細胞株3A10、3B09、3B12。在后續研究中，各單克隆抗體以其來源的細胞株命名。以重組IL-27EBI3和IL-12p35作為陽性對照，以空表達載體轉化的大腸桿菌 (BL21 star(DE3)) 裂解液作為陰性對照，Western blotting對上述細胞株分泌抗體的抗原特異性進行了鑒定 (表2)。結果表明，單抗3B11、3D07、3E10都能與重組IL-27EBI3發生免疫反應，3B11和3D07同樣能與含有EBI3亞基的IL-27和IL-35發生免疫反應，與不含EBI3亞基的IL-12和IL-23不發生免疫反應，同時也不具備與IL-6和IL-10的免疫反應性，而3E10與IL-12和IL-23都具有交叉反應。單抗3A10、3B09、3B12都能與重組IL-12p35發生免疫反應，3A10和3B12同樣能與含有p35亞基的IL-12和IL-35發生免疫反應，與不含p35亞基的IL-12家族成員IL-23和IL-27不發生免疫反應，同時也不具備與IL-6和IL-10的免疫反應性，而3B09與IL-23具有交叉反應。對抗原特異性較好的3B11、3D07、3A10和3B12細胞株分泌抗體的效價進行了測定 (圖3A)，發現單抗3B11效價高于3D07，3A10效價高于3B12，因而選取單抗3B11和3A10進行后續研究。用Protein A柱對單抗3B11和3A10進行純化制備，通過一步親和層析純化，純度可達到95%以上 (圖3B)。對純化樣品進行超濾濃縮，蛋白濃度可達到2 mg/mL。依照單克隆抗體亞類鑒定試劑盒的說明，以HRP標記的羊抗鼠IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM 和IgA的單抗為二抗，用夾心ELISA對單抗3A10和3B11進行了亞類鑒定，發現兩株單抗均為IgG1 (圖4)。

圖1 IL-27EBI3和IL-12p35編碼基因的RT-PCR克隆

圖2 IL-27EBI3和IL-12p35的表達與純化

表2 單克隆抗體的抗原特異性鑒定

Note: “+” means there is immunoreactivity between the mAb and antigens. “?” means there is no immunoreactivity between the mAb and antigens. Recombinant IL-27EBI3 and IL-12p35 were used as positive control and the cell lysates of BL21(DE3) transformed with the blank vector was used as negative control.

圖3 單克隆抗體的效價及純化

圖4 單抗3A10和3B11的亞類鑒定

2.3 雙抗夾心檢測IL-35方法的建立

以抗IL-27EBI3的單抗3B11作為包被抗體，捕獲樣品中的IL-35，以生物素化的抗IL-12p35單抗3A10作為檢測抗體，用Streptavidin-HRP及其底物TMB作為顯色手段，建立雙抗夾心檢測IL-35的方法。首先，我們確定了該檢測方法中包被抗體3B11和生物素化抗體3A10的最佳用量，如圖5A所示，用3種不同包被濃度的單抗3B11和3種不同濃度的生物素化單抗3A10進行組合，對系列濃度的IL-35進行了夾心ELISA檢測。以IL-35濃度為橫坐標，450為縱坐標，曲線明顯分為3個群，剛好代表了生物素化單抗3A10的工作濃度，工作濃度越高，450越大，其對450值的影響遠遠大于單抗3B11的包被濃度。以450值≥0.2為陽性cutoff值，圖中曲線與直線450為0.2交點所對應的軸的數據即為相應條件下IL-35的最低檢測濃度，可見生物素化單抗3A10的工作濃度為500 ng/mL時IL-35的檢測靈敏度最高。而在同一生物素化單抗3A10用量的條件下，單抗3B11的包被濃度10 μg/mL、5 μg/mL及1 μg/mL檢測的敏感性差異不大，說明單抗3B11包被濃度為1 μg/mL已足夠。以確定的最佳抗體使用濃度建立標準的夾心ELISA，并對序列濃度的重組IL-35進行檢測。當IL-35濃度在200 pg/mL濃度以下時，檢測呈現出較好的線性，在400 pg/mL和800 pg/mL時測定值偏離線性，比理論線性值偏小，可能與IL-35在200 pg/mL時的結合達到飽和有關。選擇200 pg/mL及其以下濃度與對應的450值作圖并進行線性回歸，得到了回歸曲線和線性方程(圖5B)，該檢測方法的線性范圍在1.56–200 pg/mL。

圖5 IL-35 ELISA檢測方法的建立

2.4 雙抗夾心檢測IL-35方法的靈敏度、特異性、精密度和準確度

按照靈敏度的測定方法，我們測定了20個空白樣品即樣品稀釋液的450值，測定的平均值加上2倍標準差所得的值為0.174，代入回歸方程，計算出最低檢測下限為1.26 pg/mL。同時，以重組1L-12p35、重組IL-27EBI3、IL-12、IL-23、IL-27以及2個非IL-12家族細胞因子IL-6、IL-10作為待檢物對該檢測方法的特異性進行了評定，結果表明該檢測方法與IL-12家族成員1L-12p35、IL-27EBI3、IL-12、IL-23、IL-27的交叉反應率均為0.1%，與IL-6和IL-10的交叉反應率為0.1%。最后，我們對該檢測方法的精密度(重復性) 和準確度進行了評定，用該方法對高 (200 pg/mL)、中 (50 pg/mL)、低 (5 pg/mL)) 濃度的IL-35進行分批多次檢測，計算了測定的批內差和批間差，結果見表3，批內RSD為5.1%–5.6%，批間RSD為5.6%–7.2%，完全可以滿足生物樣品中IL-35的快速定量檢測。用添加回收率作為準確性的評定指標，對終濃度為高(123.6 pg/mL)、中 (43.6 pg/mL)、低(13.6 pg/mL) 的IL-35添加品進行檢測，計算出該檢測方法的添加回收率(表4) 分別為103%、90%及92%。以上實驗結果表明，該檢測方法的各項指標都達到了定量分析的要求。

3 討論

IL-35是IL-12家族的一個新型細胞因子，由Collison等于2007年最先發現并確認[1]。IL-12家族一共有4個成員，即IL-12、IL-23、IL-27和IL-35。這4個細胞因子均為異質二聚體，均由一個螺旋束樣細胞因子亞單位(p35、p19、p28) 和一個可溶性細胞因子受體樣亞單位(p40和EBI3) 組成。

表3 IL-35定量ELISA檢測方法的精密度

表4 IL-35定量ELISA檢測方法的添加回收率(準確度)

35、p19、p28具有同源性，EBI3和p40具有同源性，其中p35和 p40組成IL-12，p19 和p40組成IL-23，p28和EBI3組成IL-27，p35和EBI3組成IL-35[3]。IL-12家族成員的這種結構特征和同源性決定了它們在免疫檢測上的復雜性，如果用完整的細胞因子進行免疫制備單克隆抗體，很有可能篩選到抗同一亞單位的兩株抗體，而這一亞單位可能會在兩種細胞因子同時存在(如p40、EBI3)，因而應用這兩株單抗進行夾心ELISA檢測時會出現兩種細胞因子的交叉反應。為了降低出現交叉反應的可能性，我們采用了細胞因子亞單位分別進行免疫的策略，用基因工程方法，制備了IL-35兩個亞單位IL-27EBI3和IL-12p35的重組蛋白，以重組蛋白作為免疫原，制備各自的單克隆抗體，再用抗EBI3和抗p35的單抗進行夾心ELISA檢測IL-35，這就在很大程度上避免了IL-12家族中其他成員的交叉反應。但是，我們還要考慮到p35、p19、p28之間的同源性和p40、EBI3之間的同源性，如EBI3與p40具有27%的氨基酸同源性，而且空間結構極為相似，兩者具有相似的空間抗原表位，EBI3刺激產生的抗體有可能與p40發生交叉反應。因而在本研究中，對用重組EBI3和p35作為抗原篩選出的單克隆抗體株還需作進一步的特異性鑒定，以確定其是否與IL-12家族的其他成員之間具有交叉反應。我們發現抗EBI3的單抗3E10與IL-12和IL-23都具有交叉反應，抗p35的單抗3B09與IL-23具有交叉反應，這種交叉反應的單抗在篩選的3株抗p35和3株抗EBI3單抗中各有1株，所占比率不小，但是否確實是與p40亞基或p19亞基發生交叉反應還有待進一步證實。利用鑒定出的特異性較好的單抗3A10和3B11建立的夾心ELISA與IL-12家族的另外3個成員IL-12、IL-23、IL-27的交叉反應率均為0.1%，在檢測上能有效地排除同家族中其他3個細胞因子成員的干擾，說明用IL-12家族的其他細胞因子成員對制備單抗的特異性作進一步鑒定顯得尤為重要，是篩選出特異性檢測抗體的關鍵。本研究制備IL-12家族細胞因子的特異性檢測抗體的思路和方法可為其他家族細胞因子檢測抗體的制備提供一定的借鑒和參考。

IL-35結構上與其他IL-12家族成員相似，但其表達和分泌方式卻不同，小鼠IL-35組成型表達于CD4+CD25+Foxp3+Treg，而人類CD4+CD25+Foxp3+Treg卻不能組成型表達IL-35，其表達需要炎癥信號的刺激[4,24]。不僅如此，人類胸腺、淋巴結、扁桃體及外周血來源的T細胞亞群，包括效應性T細胞，幼稚或記憶CD4+T細胞及γδT細胞均不組成型表達IL-35[25]。IL-35的這種表達方式給其兩個亞基p35和EBI3的基因克隆帶來了困難。最近Li等[25]的研究表明，IL-35除了表達于炎癥信號刺激的T細胞系外，還可表達于炎性因子(TNF-α、IL-1β、IFN-γ) 刺激的血管內皮細胞、主動脈平滑肌細胞及單核細胞等非T細胞系。本研究中，在體外培養了人臍靜脈內皮細胞(HUEVC)，用TNF-α進行刺激，利用RT-PCR成功克隆了IL-35兩個亞基p35和EBI3的編碼基因，為后續p35和EBI3的重組蛋白和單抗的制備提供了有力保障。HUEVCs可通過胰酶灌注新生兒臍帶制備單細胞懸液而獲得，來源較為豐富，容易獲得。其次，HUEVCs在體外容易進行原代培養，用ECM培養基常規培養就可以獲得大量細胞。盡管目前還沒有在炎性刺激的HUEVCs細胞中克隆IL-35編碼基因的報道，但HUEVCs的獲得和培養比CD4+CD25+Foxp3+Treg的獲得和培養更為容易。我們認為，炎癥因子刺激的HUEVCs可作為IL-35編碼基因來源的一個重要模式細胞。

目前，國內還沒有自主研發的IL-35檢測試劑盒，主要依賴于進口。鑒于IL-35生物學功能以及其與多種疾病的相互關系還有待進一步的深入研究，研發其檢測試劑盒顯得尤為重要。我們用單抗雜交瘤技術制備了IL-35的單克隆抗體，建立了雙抗夾心的ELISA檢測方法，該方法的靈密度、特異性、精密度和準確度都達到了定量分析的要求，為組裝成IL-35 ELISA檢測試劑盒打下了堅實的基礎。我們將進一步尋求維持該檢測方法中涉及到的各種試劑和蛋白的穩定性及有效保存方法，并在臨床和科研標本中進行大批量的預試和性能評定，力爭組裝成具有自主知識產權的IL-35檢測試劑盒。該方法不僅操作簡便，檢測成本低，而且可較短時間內完成IL-35的定量分析，值得在高校、科研院所和醫療單位推薦使用。

[1] Collison LW, Workman CJ, Kuo TT, et al. The inhibitory cytokine IL-35 contributes to regulatory T-cell function. Nature, 2007, 450(7169): 566–569.

[2] Collison LW, Chaturvedi V, Henderson AL, et al. IL-35-mediated induction of a potent regulatory T cell population. Nat Immunol, 2010, 11(12): 1093–1101.

[3] Collison LW, Vignali DAA. Interleukin-35: odd one out or part of the family? Immunol Rev, 2008, 226(1): 248–262.

[4] Chaturvedi V, Collison LW, Guy CS, et al. Cutting edge: human regulatory T cells require IL-35 to mediate suppression and infectious tolerance. J Immunol, 2011, 186(12): 6661–6666.

[5] Teymouri M, Pirro M, Fallarino F, et al. IL-35, a hallmark of immune-regulation in cancer progression, chronic infections and inflammatory diseases. Int J Cancer, 2018, 143(9): 2105–2115.

[6] Xue WH, Yan D, Kan QC. Interleukin-35 as an emerging player in tumor microenvironment. J Cancer, 2019, 10(9): 2074–2082.

[7] Su LC, Liu XY, Huang AF, et al. Emerging role of IL-35 in inflammatory autoimmune diseases. Autoimmun Rev, 2018, 17(7): 665–673.

[8] Vieyra-Lobato MR, Vela-Ojeda J, Montiel-Cervantes L, et al. Description of CD8+regulatory T lymphocytes and their specific intervention in graft-versus-host and infectious diseases, autoimmunity, and cancer. J Immunol Res, 2018, 2018: 3758713.

[9] Branchett WJ, Lloyd CM. Regulatory cytokine function in the respiratory tract. Mucosal Immunol, 2019, 12(3): 589–600.

[10] Wang ZH, Liu JQ, Liu ZZ, et al. Tumor-derived IL-35 promotes tumor growth by enhancing myeloid cell accumulation and angiogenesis. J Immunol, 2013, 190(5): 2415–2423.

[11] Niedbala W, Wei XQ, Cai BL, et al. IL-35 is a novel cytokine with therapeutic effects against collagen-induced arthritis through the expansion of regulatory T cells and suppression of Th17 cells. Eur J Immunol, 2007, 37(11): 3021–3029.

[12] Kochetkova I, Golden S, Holderness K, et al. IL-35 stimulation of CD39+regulatory T cells confers protection against collagen II-induced arthritis via the production of IL-10. J Immunol, 2010, 184(12): 7144–7153.

[13] Nishino R, Takano A, Oshita H, et al. Identification of Epstein-Barr virus-induced gene 3 as a novel serum and tissue biomarker and a therapeutic target for lung cancer. Clin Cancer Res, 2011, 17(19): 6272–6286.

[14] Zeng JC, Zhang Z, Li TY, et al. Assessing the role of IL-35 in colorectal cancer progression and prognosis. Int J Clin Exp Pathol, 2013, 6(9): 1806–1816.

[15] Gu XB, Tian T, Zhang B, et al. Elevated plasma interleukin-35 levels predict poor prognosis in patients with non-small cell lung cancer. Tumour Biol, 2015, 36(4): 2651–2656.

[16] Zhang YQ, Sun H, Wu H, et al. Interleukin 35 is an independent prognostic factor and a therapeutic target for nasopharyngeal carcinoma. Contemp Oncol (Pozn), 2015, 19(2): 120–124.

[17] Liang YF, Chen QQ, Du WJ, et al. Epstein-Barr virus-induced gene 3 (EBI3) blocking leads to induce antitumor cytotoxic T lymphocyte response and suppress tumor growth in colorectal cancer by bidirectional reciprocal-regulation STAT3 signaling pathway. Mediators Inflamm, 2016, 2016: 3214105.

[18] Jin P, Ren H, Sun W, et al. Circulating IL-35 in pancreatic ductal adenocarcinoma patients. Hum Immunol, 2014, 75(1): 29–33.

[19] Ning XW, Jian ZJ, Wang W. Low serum levels of interleukin 35 in patients with rheumatoid arthritis. Tohoku J Exp Med, 2015, 237(2): 77–82.

[20] Boissier MC, Assier E, Biton J, et al. Regulatory T cells (Treg) in rheumatoid arthritis. Joint Bone Spine, 2009, 76(1): 10–14.

[21] Cheng ST, Yuan D, Liu Y, et al. Interleukin-35 level is reduced in patients with chronic Hepatitis B virus infection. Int J Med Sci, 2018, 15(2): 188–194.

[22] Tsuda M, Zhang WC, Yang GX, et al. Deletion of interleukin(IL)-12p35 induces liver fibrosis in dominant-negative TGF-β receptor type II mice. Hepatology, 2013, 57(2): 806–816.

[23] Sharafi SM, Shirzad H, Khanahmad H, et al. Monoclonal antibodies production against a 40 kDa band of hydatid cyst fluid. Recent Pat Biotechnol, 2018, 12(1): 57–64.

[24] Bardel E, Larousserie F, Charlot-Rabiega P, et al. Human CD4+CD25+Foxp3+regulatory T cells do not constitutively express IL-35. J Immunol, 2008, 181(10): 6898–6905.

[25] Li XY, Mai JT, Virtue A, et al. IL-35 is a novel responsive anti-inflammatory cytokine—a new system of categorizing anti-inflammatory cytokines. PLoS ONE, 2012, 7(3): e33628.

Preparation of monoclonal antibodies against human interleukin-35 and their application in a quantitative ELISA for interleukin-35 detection

Fengrong He1,2, Ying Sun2, Xin Yue2, Yong Liu2, and Mengyuan Liu1,2,3

1 State Key Laboratory of Biocatalysis and Enzyme Engineering, College of Life Sciences, Hubei University, Wuhan 430062, Hubei, China 2 Wuhan Coud-clone Science and Technology Co. Ltd, Wuhan 430056, Hubei, China 3 National and Local Joint Engineering Research Center of High-throughput Drug Screening Technology, Wuhan 430062, Hubei, China

To establish a quantitative ELISA for human interleukin-35 (IL-35) detection, we cloned cDNAs encoding the 2 subunits IL-27EBI3 and IL-12p35 of IL-35 by RT-PCR and transformed the cDNAs intoBL21 star (DE3) by recombinant DNA technology. IL-27EBI3 and IL-12p35 were expressed as recombinant proteins and used as immunogen to immunize Balb/c mice. Spleen cells from the positive serum mice were isolated and fused with SP-2/0 myeloma cells. We obtained the hybridoma cell lines stably secreting target antibodies by indirect ELISA screening of the cell supernatants with recombinant IL-27EBI3 and IL-12p35 as antigen and consecutive subcloning of the cells in the well with positive supernatant. Following further measurement of supernatant titers of the antibodies and identification of their antigen specificity, we obtained a hybridoma cell line 3B11 that stably secrets antibody against IL-27EBI3 and a hybridoma cell line 3A10 that secrets antibody against IL-12p35. Both monoclonal antibodies (mAbs) were identified as the subtype of IgG1. Finally, using the anti-IL-27EBI3 mAb from 3B11 as the capture antibody and the anti-IL-12p35 mAb from 3A10 as the secondary antibody, we established a quantitative double-antibodies sandwich ELISA for IL-35 detection with-Results demonstrated that the quantitative assay had a detection range of 3.12–200 pg/mL, a detectability of 1.26 pg/mL, and a crossing-reactive rate of 0.1%. The intra-batch RSD and the inter-batch RSD of the quantitative assay were 5.1%–5.6% and 5.6%–7.2%, respectively, and the fortified recovery was 89%–103%. Therefore, the sandwich ELISA assay for IL-35 meets the qualification of quantitative analysis and laid a stable foundation for the development of quantitative ELISA kit for IL-35 detection.

human interlukin-35, monoclonal antibody, quantitative ELISA, kit

April 8, 2019;

July 9, 2019

National Natural Science Foundation of China (No. 30973669/H3004), Key Science-Technology Foundation of Hubei Provincial Department of Education (No. D20141002).

Mengyuan Liu. Tel: +86-27-88661237; Fax: +86-27-88666106; E-mail: liumengy@tom.com

10.13345/j.cjb.190129

國家自然科學基金(No. 30973669/H3004)，湖北省教育廳重點研究計劃項目 (No. D20141002) 資助。

2019-07-22

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20190722.0917.001.html

何峰容, 孫穎, 樂鑫, 等. 人IL-35單克隆抗體制備及其在定量ELISA檢測方法中的應用. 生物工程學報, 2019, 35(9): 1723–1735.

He FR, Sun Y, Yue X, et al. Preparation of monoclonal antibodies against human interleukin-35 and their application in a quantitative ELISA for interleukin-35 detection. Chin J Biotech, 2019, 35(9): 1723–1735.

(本文責編 陳宏宇)