口服肝素與小鼠腸道菌群的相互作用

周雪，王怡，何東，曾文，張翀，薛正蓮，邢新會

口服肝素與小鼠腸道菌群的相互作用

周雪1，王怡2，何東2，曾文2，張翀2，薛正蓮1，邢新會2

1 安徽工程大學 生物與化學工程學院，安徽 蕪湖 241000 2 清華大學 化學工程系生物化工研究所 工業生物催化教育部重點實驗室 合成與系統生物學中心，北京 100084

口服肝素藥物的開發需要系統地理解口服肝素與腸道菌群之間的互作過程。通過熒光體視鏡觀察熒光素標記的肝素經小鼠口服后在體內的分布情況，利用高效液相色譜法檢測肝素在模擬胃腸液中的穩定性和體外培養腸道菌群模擬腸道菌對肝素的降解作用，發現口服肝素主要分布在小鼠胃腸道內，在體外模擬胃腸液條件下肝素結構穩定，但能夠被添加肝素的厭氧培養基培養后的腸道菌群降解。為了進一步揭示口服肝素對健康小鼠腸道菌群的影響，利用Illumina MiSeq高通量測序技術測定口服肝素后C57BL/6J小鼠糞便菌群的16S rRNA序列，與口服生理鹽水的小鼠糞便菌群進行對比，發現口服肝素的小鼠糞便菌群的生物多樣性降低；在門水平上，菌群結構差異不顯著；而在屬水平上，別樣桿菌屬、副薩特氏菌屬和艾克曼菌屬相對豐度增高，而嗜膽菌屬、腸桿菌屬、瘤胃梭菌屬、普雷沃氏菌科、瘤胃梭菌屬、擬桿菌屬、、和的相對豐度減少，表明口服肝素能夠影響小鼠腸道菌群結構。此外，實驗發現口服肝素對小鼠無明顯毒副作用，具有較高安全性。研究結果將為開發肝素口服遞送策略提供新的思路，為口服肝素類藥物的開發提供參考。

肝素，口服，腸道菌群，降解，胃腸道

肝素是一種天然存在于哺乳動物體內的線性多糖大分子，屬于糖胺聚糖家族。其結構中含有3-O-硫酸基的特殊五糖結構，能特異性結合血液中的AT III，從而使肝素具有抗凝活性[1-4]。肝素作為抗凝血藥物應用于臨床已有80多年的歷史，目前低分子量肝素是臨床上應用最廣泛的抗凝血藥物之一。在臨床應用中，肝素類藥物以靜脈或皮下注射給藥途徑為主，尚未見口服肝素類藥物上市。由于肝素口服制劑不僅能減少通過注射給藥的疼痛和不適，而且還有可能減少住院時間，有更好的患者依從性，因此口服肝素類藥物的開發具有重要的臨床意義和應用價值。

通常認為肝素分子量大、帶強負電、極性強等特性是導致肝素口服生物利用度低的主要原 因[5]。根據這些特性，以往的研究者已經嘗試使用多種藥物遞送劑改善口服肝素經胃腸道吸收困難的問題，包括制備肝素綴合脫氧膽酸形成復合物[6-7]、脂質體[8]、油-水乳劑以及與聚合物和納米顆粒結合等修飾方式研制腸溶肝素制劑等[9-11]。但是有關口服肝素在體內的吸收代謝途徑及其與腸道菌群的相互作用目前仍不明確。在大鼠靜脈和動脈血栓形成模型中，肝素經口服給藥后能在內皮細胞中發現肝素存在，并且檢測到顯著的抗血栓活性[12-13]，表明口服肝素在體內能被內皮吸收發揮作用。關于口服肝素體內分布的研究中，通過口服給與小鼠熒光標記的?；悄懰?TCA)與肝素和多西紫杉醇(DTX) 連接后的結合物，分析其在體內的分布發現該類肝素結合物能夠到達小鼠結腸部位[7]。通過口服給予大鼠0.025–15 mg/kg的亭扎肝素后，未能在給藥后24 h內的糞便中檢測出肝素[14]。口服給予狗7.5 mg/kg的肝素膠囊24 h后，結果只在1只狗的糞便中檢測到了肝素，而在實驗組內的其他狗的糞便中均未檢測到肝 素[15]。關于口服肝素后糞便中未檢測到肝素，與胃腸道對口服肝素的消化降解作用以及糞便中肝素檢測方法靈敏度相關。因此考察消化道對口服肝素的影響，需要了解口服肝素在胃液、小腸液和結腸液環境中的穩定性以及腸道菌群對肝素的降解能力。

解析口服肝素的體內活性以及生物利用度面臨的另一個關鍵問題是闡明肝素與腸道菌群的相互作用。由于肝素糖鏈結構復雜以及高度硫酸化特性使其不易被降解，目前已知肝素酶可以通過識別特定底物裂解位點破壞糖苷鍵降解肝素[16]，定殖于人體的多形擬桿菌能夠利用自身編碼的糖苷水解酶(GH)/多糖裂解酶(PL) 和硫酸酯酶協同作用克服糖胺聚糖的硫酸化問題降解肝素[17]，在厚壁菌門的大型基因組研究中發現存在一類可能有助于肝素代謝的GH或PL位點[18]。通過分析腸道菌群降解肝素的能力，考察腸道菌群對口服肝素穩定性和抗凝活性的影響，為進一步解析口服肝素在消化道內的代謝和吸收提供基礎。關于肝素對腸道菌群影響的研究中，Duan等[19]利用變性梯度凝膠電泳(PCR-DGGE)，探索了口服肝素兩周后的小鼠腸道菌群變化，發現與口服生理鹽水的小鼠相比，口服肝素的小鼠糞便菌群中的乳桿菌變多而腸球菌減少，暗示口服肝素會對腸道菌群結構產生影響。但是該研究僅采用PCR-DGGE進行了菌群解析，能得到的信息有限，無法全面揭示口服肝素對腸道菌群結構變化的影響。

綜上所述，雖然目前的研究初步揭示了口服肝素在有些條件下能夠進入體內循環系統的現象，但大部分研究尚處在探索階段，僅就口服肝素在體內不同臟器內的分布進行了探索，而且不同研究采用的肝素形態和動物模型不同，遠遠沒有獲得面向口服藥物研制的統一結論，對口服肝素在胃腸內的動態變化及其與腸道菌群的相互作用過程的系統研究還很初步。因此，需要不斷建立全面解析肝素在動物體內分布及其作用機制的方法。為了系統地揭示口服肝素在胃腸道的變化及其與腸道菌群的互作，本研究采用健康小鼠作為動物模型，通過檢測熒光肝素在小鼠體內的分布和在模擬胃腸液中的穩定性，建立體外檢測腸道菌群對肝素降解作用的評價方法，并結合Illumina MiSeq測序技術研究口服肝素對健康小鼠腸道菌群結構的影響。

本研究的意義在于通過分析口服肝素在健康模式動物胃腸道內的穩定性，分析可能影響口服肝素發揮作用的因素，為未來進一步研究口服肝素遞送藥物增加肝素在體內的吸收提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

肝素(河北常山生化藥業股份有限公司，原料藥級，Mw：(16 430±40) Da，抗Xa因子活性：(191.8±5.7) IU/mg)、厭氧肉湯培養基(青島海博生物科技有限公司)、氯化血紅素(上海阿拉丁試劑有限公司)、維生素K1 (上海阿拉丁試劑有限公司)、糞便基因組提取試劑盒(DP328-02，天根生化科技有限公司)、采用細菌基因組提取試劑盒(DP302-02，天根生化科技有限公司)、疊氮化鈉(色譜純，Biotopped公司)、無水硫酸鈉(色譜純，Sigma公司)、TSK-GEL G2000SWXL (TOSOH公司)、C57BL/6J小鼠(清華大學實驗動物中心購買)。

1.2 方法

1.2.1 熒光肝素在體內代謝分布測定

熒光肝素制備：將肝素溶液(100 mg/mL)、Texas Red酰肼(Thermo Fisher Scientific公司，100 mg/mL溶于DMSO) 和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC，20 mg/mL) 按 10︰3︰3比例混合后，室溫避光孵育2 h，再添加少量EDC (總濃度1 mg/mL)，過夜孵育，利用3.5 kDa透析袋徹底透析除鹽并凍干后得到Texas Red標記的肝素。

C57BL/6J雄性小鼠(周齡：6–8周) 購自清華大學實驗動物中心，小鼠為無特定病原體(SPF)級，在清華大學實驗動物中心的屏障環境中飼養，飼養環境為12 h光照/12 h黑暗循環，溫度控制為(22.5±2.5) ℃，濕度控制為50%±5%。在C57BL/6J雄性小鼠禁食24 h后，口服給與熒光肝素溶液(25 mg/kg) 10 h后，眼眶取血并斷頸處死小鼠后進行解剖，采集小鼠的心、肝、脾、肺、腎、胃、小腸和結腸組織樣品，在4 ℃ PBS緩沖液中短暫儲存，之后使用熒光體視鏡觀察上述組織中的熒光肝素分布情況，實驗中使用錫箔紙封好的離心管以避光保存小鼠器官。

1.2.2 肝素胃腸液穩定性測定

配制模擬胃液和模擬小腸液，模擬胃液(SGF)：胃蛋白酶1.6 g，氯化鈉2.0 g，HCl調至pH 1.2，用容量瓶定容至500 mL。模擬小腸液(SIF)：腸液素10.0 g，磷酸二氫鉀6.8 g，NaOH調pH至6.8，用容量瓶定容至500 mL。模擬結腸液：腸液素10.0 g，磷酸二氫鉀6.8 g，NaOH調至pH 7.2，用容量瓶定容至500 mL。按30 mg/mL的終濃度稱取適量肝素粉末，分別溶解于對應體積的模擬胃液、腸液和結腸液中，分別移取各溶液2 mL至標記好的離心管中，37 ℃孵育并在不同時間收獲對應的離心管，100 ℃下水浴5 min后，10 000 r/min離心10 min取1.5 mL上清液，用 0.45 μm濾頭過濾，將濾液冷凍干燥后測定肝素分子量變化。

1.2.3 肝素分子量測定

采用歐洲藥典規定的凝膠滲透色譜法測肝素分子量。使用WATERS液相檢測系統、紫外檢測器和示差檢測器串聯、TSK-GELG2000SWXL (7.8 mm×300 mm，TOSOH，日本) 進行檢測。色譜條件如下，流速：0.5 mL/min，柱溫：35 ℃，進樣體積：20 μL，紫外檢測波長：234 nm，時間：40 min，流動相：28.4 g/L無水硫酸鈉溶液，pH 5.0±0.1。

1.2.4 糞便菌懸液制備

向40 mL PBS溶液中加入20 mg半胱氨酸鹽酸鹽充分溶解后121 ℃滅菌15 min，配制成無菌預還原PBS溶液。在清華大學實驗動物中心的超凈工作臺內取5粒新鮮小鼠糞便，迅速放入含有1 mL無菌預還原PBS溶液的離心管中，冰盒中帶回實驗室。用螺旋振蕩器將糞便混勻制成菌懸液，4 ℃、1 000 r/min瞬時離心2次，取上清液作為接種菌懸液。

1.2.5 小鼠腸道菌群的體外培養

稱取60 g厭氧肉湯培養基(GAM) 溶于 1 000 mL蒸餾水中使其充分溶解后，按60 mL/ 250 mL分裝于厭氧培養瓶中，121 ℃滅菌15 min，按0.05%的終濃度分別加入過濾除菌后的維生素K1溶液與氯化血紅素溶液配制成厭氧肉湯培養基。向其中再加入過濾除菌的肝素溶液配制成含有0.5%的肝素厭氧肉湯培養基。在超凈工作臺中向厭氧瓶培養瓶中通氮氣以去除瓶中的氧氣，用無菌注射器按照0.5% (體積比) 的接種量取接種菌懸液進行接種，在恒溫搖床中，37 ℃、200 r/min下厭氧培養48 h。

1.2.6 體外培養腸道菌基因組DNA提取

采用細菌基因組提取試劑盒提取腸道菌基因組，嚴格按照試劑盒里的實驗步驟逐步操作，得到的核酸樣品使用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的基因組DNA完整性。

1.2.7 PCR擴增腸道菌群肝素酶基因

在Brenda酶庫搜索肝素酶并獲取基因序列，根據基因序列信息設計了7對引物，以體外培養的腸道菌基因組為模板，以表1中的引物進行PCR反應，通過瓊脂糖電泳和Gel Extraction kit (D2500-01，OMEGA BIO-TEK公司) 純化回收序列大小正確的擴增序列，送至南京金唯智公司進行測序。

1.2.8 肝素抗凝活性測定

肝素的抗凝血活性通過使用APTT活化部分凝血酶時間測定試劑盒(R3018，Sysmex公司) 以及抗Xa活性測定試劑盒(82098539，Chromogenix公司，發色底物法) 進行檢測，具體方法參考歐洲藥典藥品標準EP7.0及葉逢春博士論文方法[20]。

1.2.9 腸道菌群體外共孵育肝素底物

配制肝素底物緩沖液(100 mL)：Tris 0.208 7 g、NaCl 0.257 4 g、無水氯化鈣0.007 77 g，肝素1.0 g，HCl調至pH 7.0±0.1。

將厭氧培養48 h后的20 mL菌液移入離心管中，4 ℃、10 000 r/min離心15 min取沉淀，再用PBS緩沖液清洗菌體2次，將得到的菌體與肝 素底物緩沖液在30 ℃下共孵育3 h，孵育完畢后13 000 r/min離心20 min，取上清低溫冷凍干燥后，用高效液相色譜儀檢測肝素分子量變化。

1.2.10 動物實驗設計及糞便取樣

將C57BL/6J雄性小鼠(周齡：6–8周) 隨機分成兩組即灌胃生理鹽水組(WT組) 和灌胃肝素組(HP組)，每組10只。按30 mg/(kg·d)的肝素劑量連續給小鼠灌胃30 d，對照組小鼠灌胃生理鹽水，實驗過程中所有小鼠均可任意飲水與飲食。給藥期間記錄小鼠體重變化，在動物實驗中 心的超凈工作臺內采集每只小鼠灌胃后的第10、20、30天的新鮮糞便樣本，每次采集糞便后迅速置入標記過的1.5 mL無菌離心管內置于冰盒中，在實驗室–80 ℃冰箱中儲存直至分析。

1.2.11 糞便樣本基因組DNA提取

使用糞便基因組提取試劑盒提取糞便菌群基因組，嚴格按照試劑盒里的實驗步驟逐步操作，得到的核酸樣品使用超微量分光光度計測定含量，并用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的基因組DNA完整性。

1.2.12 16S rRNA微生物群落分析

通過測定16S rRNA中的V3–V4區序列，對小鼠的腸道菌群結構進行分析。高通量測序文庫構建和基于Illumina MiSeq平臺的測序工作由GENEWIZ公司(蘇州，中國) 完成。經過質量過濾，去除嵌合體序列，最終得到的序列用于操作分類單元(Opetational taxonomic unit，OTU) 分析，使用 VSEARCH (1.9.6) 進行序列聚類(序列相似性設為97%)，用參考數據庫Silva 132比對16S rRNA。然后用RDP classifier (Ribosomal Database Program) 貝葉斯算法對OTU的代表性序列進行物種分類學分析，之后分析樣本的Alpha多樣性和Beta多樣性，統計每個樣本的群落組成。

1.2.13 結腸長度、脾重指數與組織學分析

給藥周期結束后，給予小鼠安樂死，并解剖小鼠獲得全段結腸組織，用標尺測量小鼠結腸長度后，取一部分結腸組織置于10%福爾馬林中固定，之后制作腸組織石蠟切片，再對切片進行蘇木精-伊紅染色，通過顯微鏡觀察拍照。另取小鼠脾臟，在分析天平上測定濕重并記錄，計算出脾重指數，即脾重指數=脾臟重量(mg)/體重(g)。結果以mg/10 g體重表示。

表1 肝素酶引物序列

1.2.14 統計學分析

所有實驗均有生物學重復，所有數據均以平均值±標準偏差表示。生物統計學顯著性差異使用Origin Lab軟件(Origin Pro 8.0，Origin Lab Co，Northampton，MA，USA) 進行單向方差分析(ANOVA)，<0.05為差異有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 口服熒光肝素的小鼠體內分布

使用熒光體式鏡分別觀察口服灌胃熒光肝素10 h后，小鼠的心、肝、脾、肺、腎、胃、小腸和結腸的熒光肝素分布情況。如圖1所示，熒光肝素主要分布在小鼠的胃、小腸的食糜中以及結腸部位(圖1A)；而在小鼠的心、肝、脾、肺、腎的剖面并未觀察到熒光肝素的存在(圖1B)，同時血清中也未檢測到熒光肝素信號。表明口服肝素10 h后肝素主要集中存在于胃腸道中，未經血液循環進入到腸外其他臟器中。由此可以推測，小鼠口服肝素后，胃腸道環境是影響口服肝素代謝與穩定性的主要因素之一，因此需要了解口服肝素在胃腸道環境中的存在特性。

圖1 熒光肝素在小鼠體內不同組織中的分布

2.2 肝素在模擬胃腸液中的穩定性

實驗使用的肝素為未分級肝素，是一種分子量不均一的混合物，色譜峰分布較寬，保留時間為13.8 min (圖2A)。通過灌胃給藥肝素后肝素首先進入胃環境，其主要特點是酸性較強。結果發現在模擬胃液中消化12 h的肝素色譜峰的保留時間和峰面積均未變化(圖2B)，說明肝素在模擬胃液環境中比較穩定，肝素分子量無明顯變化。此外，在模擬小腸液條件下消化12 h的肝素色譜峰的保留時間和峰面積也沒有變化(圖2C)，表明肝素在模擬小腸液條件下穩定性較好。最后，肝素在模擬結腸液條件下消化24 h內的色譜峰的保留時間和峰面積沒有改變(圖2D)，表明肝素在模擬結腸液環境中穩定性高。以上實驗結果表明，模擬胃液、小腸液和結腸液對肝素的穩定性影響較小，暗示口服肝素能夠穩定到達結腸部位。

2.3 腸道菌群體外降解肝素的特性

考慮到上述模擬胃腸液為無菌狀態，而現實小鼠腸道特別是結腸段存在大量腸道菌群，因此探究口服肝素在小鼠腸道內的代謝，需要考察肝素與腸道菌群的互作關系。由于腸道內環境十分復雜，結腸內存在種類繁多且宿主難以消化的復雜多糖，會對低劑量肝素檢測產生較大的影響，且目前尚未建立檢測腸道內和糞便中肝素的有效分析方法。因此，我們通過體外培養糞便菌群的方法，間接推測結腸中腸道菌群對肝素的影響。在體外使用添加肝素的厭氧肉湯培養基培養糞便菌群，收集并測定培養0、2、6、24 h時培養液中的肝素，發現培養液中的肝素色譜峰保留時間一致。但是在同樣的樣品制備條件下，隨著培養時間延長不同培養液中的肝素峰面積逐漸減小(圖3A)，表明肝素能被厭氧瓶中培養的腸道菌群降解。與添加肝素的厭氧肉湯培養基培養的腸道菌群細胞體外共孵育后的肝素色譜圖明顯右移，保留時間增大，肝素分子量變小，出現與低分子肝素色譜圖相似的寡糖色譜峰(圖3 B)，進一步表明體外培養的腸道菌群可以利用肝素且能將大分子肝素降解為小分子肝素。由此推測，體外培養的小鼠腸道菌群中存在能夠降解肝素的菌屬，暗示腸道菌群會對口服肝素產生影響。

圖2 肝素在模擬胃腸液中的高效液相色譜圖

為了進一步獲得培養菌群降解肝素的分子證據，進一步提取體外培養的腸道菌群基因組(圖4 A)，利用肝素酶引物對該基因組進行PCR擴增，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測得到擴增后的DNA電泳條帶(圖4B)。并對DNA進行回收、純化與測序后，在NCBI中進行序列比對，其中A引物擴增得到的序列與多形擬桿菌7330編碼的肝素酶Ⅱ()相似度達99% (Sequence ID: CP012937.1)，G引物擴增得到的序列與解纖維素擬桿菌WH2編碼的肝素酶Ⅱ()相似度達97% (Sequence ID: CP012801.1)。肝素酶Ⅱ是以肝素和硫酸乙酰肝素為底物，裂解2-O硫酸化的糖醛酸的典型肝素酶。上述結果進一步證明體外培養的腸道菌群中可能存在產生肝素酶Ⅱ的菌群，從而發揮了降解肝素的作用。此外，為研究腸道菌群降解后的肝素抗凝活性變化，檢測了被體外培養的腸道菌群降解后肝素的活化部分凝血活酶時間(APTT) 和抗Xa因子活性。結果發現，與原肝素相比，其抗凝活性沒有明顯下降趨勢仍具有抗凝活性(表2)，說明培養腸道菌群降解后的肝素仍有抗凝活性，該結果為口服抗凝肝素研制提供了參考。

圖3 肝素體外降解色譜圖

圖4 細菌基因組及PCR產物電泳圖

2.4 口服肝素對健康小鼠腸道菌群的影響

2.4.1 口服肝素對健康小鼠腸道菌群的總體結構影響

本文通過測定糞便菌群的16S rRNA的V3–V4區，分析第10、20、30天的HP組與WT組小鼠的糞便菌群差異。在移除不合格序列后，每個樣品平均獲得約70 000–90 000萬條序列信息。根據97%的序列相似性分析，在不同時間點的WT組和HP組中都鑒定出435個以上的OTUs，測序數據量相同時，在灌胃第10、20、30天時HP組OTUs數目均高于WT組(表3)。對于不同組中的所有樣品序列，Goods_coverage較高幾乎完全覆蓋(表3)，表明該測序方法可以表征腸道菌群的真實組成。分析Alpha多樣性發現，在灌胃第10、20、30天時HP組與WT組相比差異不顯著，但在灌胃第10天時與WT組相比HP組中Shannon和Simpson值顯著下降(<0.05)。以上結果表明，灌胃肝素對健康小鼠的腸道菌群結構有影響。

表2 經體外培養腸道菌群降解后肝素抗凝活性

FL: fiducial limit.

為了進一步驗證上述結果，應用了Venn圖解分析，主坐標分析(PCoA) 和聚類分析(圖5)。如圖5A所示，大部分OTUs是WT組和HP組共有的，少數是各自獨特的OTUs，其中灌胃30 d后的小鼠特有的OTUs數最多。PCoA評分圖揭示了HP組小鼠的腸道菌群與WT組相比存在差異，但相同處理不同天數的小鼠的微生物群差異較小(圖5B)。聚類分析也表明WT組和HP組微生物群之間存在差異性(圖5C)。這些結果進一步證實了灌胃肝素能在一定程度上調節健康C57BL/6J小鼠的腸道菌群結構。

表3 不同灌胃時間的HP組及WT組小鼠腸道菌群多樣性指數

圖5 灌胃肝素對小鼠腸道菌群結構影響

2.4.2 灌胃肝素對小鼠腸道菌群中特定菌屬的影響

為了分析HP灌胃后的小鼠腸道菌群結構變化，在門和屬水平上比較了灌胃不同時間HP組和WT組小鼠的菌群結構差異。如圖6A所示，在門水平上，WT組和HP組小鼠腸道菌群中優勢菌門組成無差異，主要由厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門、脫鐵桿菌門和放線菌門等菌門構成。在第30天時HP組和WT組中擬桿菌門相對豐度均有增高趨勢，但是差異不顯著。在門水平上，相同時間點HP組與WT組間菌群沒有顯著差異，通過對3個時間點的WT組和HP組內樣品進行LEfSe分析，在屬水平上發現了兩組中分別對腸道菌群結構差異性影響較大的微生物。圖6B、6C和6D中顯示了灌胃后第10、20、30天時WT組和HP組內的樣本基于LDA分值分析得到的柱狀圖，柱狀圖中展示了兩個組別中分別對菌群結構差異貢獻較大的標志性微生物。由圖6B所示，在灌胃第10天時WT組與HP組腸道菌群存在一定差異，HP組中對菌群結構差異影響較大的微生物主要是來自變形菌門Proteobacteria中的、疣微菌門Verrucomicrobia中的和等，WT組中對菌群結構差異影響較大的微生物是、羅斯氏菌屬、、顫桿菌克屬、厭氧棍狀菌屬和；由圖6C所示，在灌胃20 d時HP組中對菌群結構差異影響較大的優勢菌為丁酸弧菌屬、、r和，而WT組中的優勢菌為、以及；在灌胃30 d時發現 (圖6D)，在HP組對菌群結構差異影響較大的和等豐度升高，而、和_等豐度降低。說明口服肝素能夠改變小鼠腸道中某些菌屬的相對豐度，對健康C57BL/6J小鼠腸道菌群結構有調節作用。

圖6 灌胃肝素在門和屬水平對腸道菌群的影響

2.5 口服肝素的體內藥物安全性

分別檢測連續灌胃30 d肝素和灌胃生理鹽水后健康小鼠的體重、結腸長度、脾重指數和結腸組織結構變化，初步分析口服肝素的生物安全性。如圖7A所示，HP組與WT組的小鼠體重變化趨勢一致。通過測定WT組和HP組小鼠的結腸長度以及觀察結腸組織結構HE染色切片，分析口服肝素對小鼠結腸的宏觀結構影響。發現WT組與HP組小鼠的結腸長度無統計學差異(圖7B)。HP組與WT組小鼠的結腸結構相似，腸粘膜完整無脫落，隱窩結構正常，上皮細胞排列整齊，形態正常(圖7C)，提示長期口服肝素對小鼠的結腸長度、結構無顯著影響。脾重指數是粗略反映機體免疫能力強弱的指標，如圖7D所示，灌胃肝素30 d后HP組與WT組的脾重指數也無生物統計學差異，說明口服灌胃肝素30 d對小鼠的免疫功能無明顯影響。以上結果均表明口服肝素對健康小鼠具有較高安全性。

圖7 口服肝素對小鼠生長的影響

3 討論

本研究首先通過體外菌群培養和動物實驗，結合高效液相色譜法等現代儀器分析手段以及Illumina高通量測序技術，對肝素和腸道菌群的相互作用過程進行分析，初步探究了腸道菌群對肝素的降解作用和口服肝素對小鼠腸道菌群的調節作用。體外實驗結果表明，肝素在模擬胃腸液中的穩定性高，不易被降解。之前的研究也表明肝素中糖苷鍵不易被酸水解，其中的O-硫酸基對酸水解相當穩定，而在堿性條件下，N-硫酸基相當穩定[21-22]。實驗證明肝素能夠被體外培養的腸道菌群降解，目前相關代謝組學研究也發現糞便菌群能夠編碼豐富多樣的復雜多糖降解酶，特別是擬桿菌門中的菌屬[23]。通過檢測體外培養的腸道菌群降解后的肝素的抗凝血活性，發現降解前后肝素抗凝活性變化較小，這與前人研究報道提及的經肝素酶Ⅱ和Ⅲ降解的肝素仍有抗凝活性的結果一致[24]。這一結果表明，盡管腸道菌群能夠降解口服肝素，但其抗凝活性仍能夠保持，為未來口服肝素藥物遞送策略的研究提供了參考。

體內動物實驗表明口服熒光標記的肝素主要分布在小鼠胃腸道內，這與之前一項口服熒光肝素復合物在體內代謝研究結果一致，熒光肝素主要在回腸積累，在結腸中也有分布[7]。分析糞便菌群的16S rRNA序列發現，長期口服肝素的小鼠腸道菌群結構發生變化，與WT組相比灌胃肝素后小鼠的腸道菌群多樣性降低；在屬水平上，口服肝素使腸道菌群中的某些菌屬，如、、、、和的相對豐度增加?，F在已經發現菌屬能夠產生琥珀酸，細菌來源的琥珀酸鹽通過促進嚴格厭氧細菌的定殖，對宿主產生有益作用[25]；其中的和菌屬中的某些菌屬被發現能夠產生短鏈脂肪酸[26-28]；而菌屬中的被認為是一種很有前景的益生菌，能夠降解腸粘蛋白生成短鏈脂肪酸[29]，與肥胖、糖尿病、心臟代謝疾病和低度炎癥呈負相關[30-31]，另外還有研究發現它能粘附于腸上皮細胞并在體外增強腸上皮單層細胞完整性，增強受損腸道的屏障功能[32]?？诜嗡睾蟆⒕鷮俚南鄬ωS度減少。其中被發現在前驅糖尿病患者體內豐度增高[33]；菌屬中的沃氏嗜膽菌是一種能夠引起和加重炎癥的致病菌[34-35]。

最后，在口服肝素生物安全性方面，本研究表明長時間口服肝素沒有對小鼠的生長產生明顯負面影響，表明口服肝素安全性高。這與Kim等[36]用低分子量肝素-脫氧膽酸鹽結合物對小鼠口服毒性研究結果一致，該研究中沒有造成小鼠的體征參數以及死亡率的變化，通過延長給藥時間至4周小鼠也無死亡和體重下降現象。綜上所述，口服灌胃肝素能夠被腸道菌群降解，能夠在一定程度上調節腸道菌群結構，這可能與口服肝素的生物利用度和體內生物活性的發揮有關，為未來口服肝素類藥物的開發及藥效解析提供參考。

[1] Torri G, Naggi A. Heparin centenary – an ever-young life-saving drug. Int J Cardiol, 2016, 212(S1): S1–S4.

[2] Damus PS, Hicks M, Rosenberg RD. Anticoagulant action of heparin. Nature, 1973, 246(5432): 355–357.

[3] Rosenberg RD, Lam L. Correlation between structure and function of heparin. Proc Natl Acad Sci USA, 1979, 76(3): 1218–1222.

[4] Lever R, Page CP. Novel drug development opportunities for heparin. Nat Rev Drug Discov, 2002, 1(2): 140–148.

[5] Money SR, York JW. Development of oral heparin therapy for prophylaxis and treatment of deep venous thrombosis. Cardiovasc Surg, 2001, 9(3): 211–218.

[6] Kim SK, Vaishali B, Lee E, et al. Oral delivery of chemical conjugates of heparin and deoxycholic acid in aqueous formulation. Thromb Res, 2006, 117(4): 419–427.

[7] Khatun Z, Nurunnabi M, Cho KJ, et al. Oral absorption mechanism and anti-angiogenesis effect of taurocholic acid-linked heparin-docetaxel conjugates. J Control Release, 2014, 177: 64–73.

[8] Lavanya N, Muzib YI, Aukunuru J, et al. Preparation and evaluation of a novel oral delivery system for low molecular weight heparin. Int J Pharm Investig, 2016, 6(3): 148–157.

[9] Paliwal R, Paliwal SR, Agrawal GP, et al. Recent advances in search of oral heparin therapeutics. Med Res Rev, 2012, 32(2): 388–409.

[10] Hiebert LM. Oral heparins. Clin Lab, 2002, 48(3/4): 111–116.

[11] Zhu M, Li LA, Wang GB. Recent progress in research of oral low molecular weight heparin. Chin J Mod Appl Pharm, 2010, 27(2): 105–108 (in Chinese).諸敏, 李立安, 王根寶. 低分子肝素口服制劑的國內外研究進展. 中國現代應用藥學, 2010, 27(2): 105–108.

[12] Hiebert LM, Ping T, Wice SM. Repeated doses of oral and subcutaneous heparins have similar antithrombotic effects in a rat carotid arterial model of thrombosis. J Cardiovasc Pharmacol Ther, 2012, 17(1): 110–116.

[13] Hiebert LM, Ping T, Wice SM. Enhanced antithrombotic effects of unfractionated heparin in rats after repeated oral doses and its relationship to endothelial heparin concentration. Br J Pharmacol, 2010, 153(6): 1177–1184.

[14] Hiebert LM, Wice SM, Ping T. Tissue distribution of the low molecular weight heparin, tinzaparin, following administration to rats by the oral route. Biomed Pharmacother, 2004, 58(6/7): 372–380.

[15] Erickson M, Hiebert LM, Carr AP, et al. Effect of oral administration of unfractionated heparin (UFH) on coagulation parameters in plasma and levels of urine and fecal heparin in dogs. Can J Vet Res, 2014, 78(3): 193–201.

[16] Desai UR, Wang HM, Linhardt RJ. Specificity studies on the heparin lyases from. Biochemistry, 1993, 32(32): 8140–8145.

[17] Cartmell A, Lowe EC, Baslé A, et al. How members of the human gut microbiota overcome the sulfation problem posed by glycosaminoglycans. Proc Natl Acad Sci USA, 2017, 114(27): 7037–7042.

[18] Sheridan PO, Martin JC, Lawley TD, et al. Polysaccharide utilization loci and nutritional specialization in a dominant group of butyrate-producing human colonic. Microb Genom, 2016, 2(2): e000043.

[19] Duan RS, Chen XE, Wang FS, et al. Oral administration of heparin or heparosan increases thepopulation in gut microbiota of rats. Carbohyd Polym, 2013, 94(1): 100–105.

[20] Ye FC. Design of multifunctional fusion heparinase and its application in the production of low molecular weight Heparin[D]. Beijing: Tsinghua University, 2010 (in Chinese).葉逢春. 多功能融合肝素酶的設計及其制備低分子量肝素工藝[D]. 北京: 清華大學, 2010.

[21] 張天民, 吳悟桐, 王發同. 動物生化制藥學. 北京: 人民衛生出版社, 1981: 224–225.

[22] 左耀明, 劉智. 肝素的理化特性與藥理作用. 中國生化藥物雜志, 1990(3): 44–47.

[23] Koropatkin NM, Cameron EA, Martens EC. How glycan metabolism shapes the human gut microbiota. Nat Rev Microbiol, 2012, 10(5): 323–335.

[24] Ji Y. Production of heparin derivatives using heparinases and their therapeutic effects on ulcerative colitis [D]. Beijing: Tsinghua University, 2018 (in Chinese).季洋. 酶解去抗凝肝素衍生物的制備及其治療結腸炎的功效研究[D]. 北京: 清華大學, 2018.

[25] Ju TT, Kong JY, Stothard P, et al. Defining the role of, a previously uncharacterized member of the core gut microbiota. ISME J, 2019, 13(6): 1520–1534.

[26] Bui TPN, Ritari J, Boeren S, et al. Production of butyrate from lysine and the Amadori product fructoselysine by a human gut commensal. Nat Commun, 2015, 6(1): 10062.

[27] Engels C, Ruscheweyh HJ, Beerenwinkel N, et al. The common gut microbealso contributes to intestinal propionate formation. Front Microbiol, 2016, 7: 713.

[28] Bui TPN, Shetty SA, Lagkouvardos I, et al. Comparative genomics and physiology of the butyrate-producing bacterium. Environ Microbiol Rep, 2016, 8(6): 1024–1037.

[29] de Vos WM. Microbe profile:: a conserved intestinal symbiont that acts as the gatekeeper of our mucosa. Microbiology, 2017, 163(5): 646–648.

[30] Cani PD, de Vos WM. Next-generation beneficial microbes: the case of. Front Microbiol, 2017, 8: 1765.

[31] Schneeberger M, Everard A, Gómez-Valadés AG, et al.inversely correlates with the onset of inflammation, altered adipose tissue metabolism and metabolic disorders during obesity in mice. Sci Rep, 2015, 5: 16643.

[32] Reunanen J, Kainulainen V, Huuskonen L, et al.adheres to enterocytes and strengthens the integrity of the epithelial cell layer. Appl Environ Microbiol, 2015, 81(11): 3655–3662.

[33] Yang JP, Summanen PH, Henning SM, et al. Xylooligosaccharide supplementation alters gut bacteria in both healthy and prediabetic adults: a pilot study. Front Physiol, 2015, 6: 216.

[34] Zhou F, Long WM, Hao BH, et al. A human stool-derivedstrain caused systemic inflammation in specific-pathogen-free mice. Gut Pathog, 2017, 9: 59.

[35] Schneeberger M, Everard A, Gómez-Valadés AG, et al.inversely correlates with the onset of inflammation, altered adipose tissue metabolism and metabolic disorders during obesity in mice. Sci Rep, 2015, 5: 16643.

[36] Kim JY, Jeon OC, Moon HT, et al. Preclinical safety evaluation of low molecular weight heparin-deoxycholate conjugates as an oral anticoagulant. J Appl Toxicol, 2016, 36(1): 76–93.

Interaction between orally administrated heparin and intestinal microbiota in mice

Xue Zhou1, Yi Wang2, Dong He2, Wen Zeng2, Chong Zhang2, Zhenglian Xue1, and Xinhui Xing2

1,,241000,,Key Laboratory of Industrial Biocatalysis of Ministry of EducationInstitute of Biochemical EngineeringDepartment of Chemical EngineeringCenter for Synthetic and Systems BiologyTsinghua UniversityBeijingChina

The development of orally administrated heparin drugs requires a systematic understanding of the interaction between heparin and gut flora. Thedistribution of fluorescein-labeled heparin that is orally administrated by mice was observed using fluorescein microscopy. In addition, the stability of heparin in simulated gastric and intestinal fluids, as well as thedegradation of heparin by gut flora were detected by HPLC. The results show that orally administrated heparin was mainly distributed in the gastrointestinal tract of mice, and exerted structural stability under the condition of simulated gastric and intestinal fluids. However, heparin could be degraded by intestinal flora cultured in medium containing heparin. In order to further study the effect of orally administrated heparin on intestinal flora in mice, the fecal microbiota 16S rRNA fragment of C57BL/6J mice was tested by the Illumina Mi-Seq high-throughput sequencing technology. Compared with the gut flora of mice that orally administrated by saline, the biodiversity of gut flora in mice with orally administrated heparin was decreased. The difference of microflora structure was not significant at the phylum level, and the relative abundance of,andwas increased at the genus level, and the relative abundance of,,,,,,,,,andwas reduced. These findings indicate that heparin could influence the gut flora of mice. In addition, no obvious toxic and side effects were found in mice that orally administrated heparin, suggesting the safety of orally administrated heparin.

heparin, oral administration, gut microbiota, degradation, gastrointestinal tract

April 19, 2019;

June 6, 2019

National Natural Science Foundation of China (No. 8161101047).

s: Zhenglian Xue. Tel/Fax: +86-533-2871254; E-mail: xuezl@ahpu.edu.cn

Xinhui Xing. Tel/Fax: +86-10-62772249; E-mail: xhxing@tsinghua.edu.cn

國家自然科學基金 (No. 8161101047) 資助。

2019-07-19

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20190718.1550.001.html

周雪, 王怡, 何東, 等. 口服肝素與小鼠腸道菌群的相互作用. 生物工程學報, 2019, 35(9): 1736–1749.

Zhou X, Wang Y, He D, et al. Interaction between orally administrated heparin and intestinal microbiota in mice. Chin J Biotech, 2019, 35(9): 1736–1749.

(本文責編 郝麗芳)