pSim6質粒與新型反選擇kil系統聯用在重組工程的應用

李玉娟，陳如意，楊緬峰，陳偉

pSim6質粒與新型反選擇系統聯用在重組工程的應用

李玉娟，陳如意，楊緬峰，陳偉

廣東藥科大學 生命科學與生物制藥學院 廣東省生物技術候選藥物研究重點實驗室，廣東 廣州 510006

基因工程中，無痕修飾是一種很受歡迎的基因組操作技術。反選擇系統的嚴謹性決定了無痕修飾的效率。近期有文獻報道了一種新型的反選擇系統，該系統與質粒pSim6聯用后反選擇嚴謹性較pKD46質粒更高，預示著與pSim6質粒聯用可以更高效地選擇出重組子。據此，對大腸桿菌菌株W3110、MG1655和DH10B中的4個不同的非必需基因位點 (、、和) 進行了分析，將不同長度的外源基因片段對預先插入這些位點的進行基因替換。結果表明與pSim6質粒聯用較其與pKD46質粒聯用，重組效率均有顯著提高，并且隨著外源片段的增長，效果更明顯。外源片段為1 000 bp時，與pSim6質粒聯用是其與pKD46聯用的1.2–2倍；外源片段為2 000 bp時，則是pKD46的2.2–5倍。綜上，與pSim6聯用具有更高的重組效率，更有利于大腸桿菌基因組的無痕修飾操作，這為大腸桿菌重組工程提供了更多的選擇。

Red重組系統，選擇反選擇系統，無痕修飾，大腸桿菌

同源重組是在基因工程中常用的技術手段，并且在基因打靶和基因克隆方面有著極其重要的作用。運用同源重組技術，可以對巨大、復雜的染色體進行修飾[1]。在代謝工程與功能基因組分析中，對大腸桿菌基因組修飾(點突變、插入、刪除、替換)的同源重組，一般用35–50 bp的同源臂，就可以發生有效的重組并且不需要限制性酶切位點。這種重組是由噬菌體重組酶 (λ-Red系統) 介導的，λ-Red系統是目前研究相對比較豐富的系統，它存在于λ-噬菌體左向操縱子上，其表達受pL啟動子和CI857阻遏蛋白控制，由、和這3個基因組成，表達蛋白產物分別為Exo、Beta和Gam[2]。Exo蛋白具有核酸外切酶活性，能以5′–3′方向降解雙鏈DNA末端，從而留下3′單鏈突出端DNA分子[3-4]；Beta蛋白能結合由Exo消化產生的3′單鏈末端，防止DNA被單鏈核酸酶消化，同時促進互補單鏈DNA區域間的退火，其在Red同源重組過程中起著決定性的作用[5]；Gam蛋白抑制核酸 RecBCD和 SbcCD 對線性雙鏈DNA分子的降解，協助Exo和Beta共同完成同源重組過程。運用Red重組技術進行染色體修飾主要有3種操作策略：DNA雙鏈介導的重組[6]、單鏈重組[7]和重疊引物介導的重組[8]。

在Red同源重組操作策略中，兩步選擇反選擇重組法[9]是報道最多且應用最廣泛的策略，改造后不會產生多余的基因序列變化，可以達到“無痕修飾”的目的。其策略分為兩步：1) 通過電擊轉化將帶有同源臂的選擇反選擇片段轉入大腸桿菌感受態細胞中，在Red重組系統的表達下發生同源重組，通過正向選擇標記 (一般為抗性基因如) 篩選陽性克隆；2) 同樣用電轉化將帶有同源臂的外源片段轉入細胞中，在Red重組系統的作用下進行重組，完成基因敲除、替換或插入，通過反向選擇標記基因 (如、、、和) 進行篩選[10-15]。

一般來說，反向選擇比正向選擇效率低，并且都有很高的背景[16]或者特殊的要求，如宿主基因型需要在使用陰性選擇標記基因之前修飾[17]，或者依靠最低限度的培養基來實現更好的選擇嚴謹性或需要特殊的選擇性條件。2019年，本實驗室構建并發表了一個新型的反選擇標記基因[18]。λ噬菌體的基因由溫度敏感的cI857阻遏物操控下的pL啟動子控制[19]，其表達可有效地導致宿主細胞存活力的喪失，因此將其作為反選擇標記基因。研究中發現新構建的反選擇基因比其他各種負選擇基因具有顯著的優勢：高選擇嚴謹性、低背景、不需要特殊的試劑。我們在之前的研究中，在大腸桿菌MG1655的、、非必需位點分別測試了含有pSim6質粒或含有pKD46質粒與反選擇系統聯用的選擇嚴謹性。發現pKD46質粒與聯用后選擇嚴謹性為7.6×10–7– 9.3×10–7，pSim6質粒與聯用后選擇嚴謹性較低至2.3×10–6–5.1×10–6，較pKD46高了2–5倍。因此，我們推斷，pSim6質粒與反選擇基因聯用后，雙鏈DNA片段的重組效率會比pKD46質粒與反選擇基因聯用時有所提高。

因此本研究采用含有Red同源系統的pSim6質粒，與新型的選擇反選擇系統聯合使用，在不同大腸桿菌菌株 (W3110、MG1655和DH10B) 中的4個不同位點 (、、和) 進行不同片段長度 (500 bp、1 000 bp和2 000 bp) 的替換，分析其重組效率，期望可以建立一個高選擇效率的重組工程系統，為更好地將重組工程無痕修飾提供了更多的選擇。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株和質粒：大腸桿菌菌株W3110、MG1655和DH10B為均為本室保存，GYpk1-tet (含有選擇反選擇系統) 為本室構建，pSim6質粒為美國國立衛生研究院Court DL博士惠贈。

工具酶和試劑：PrimerSTARGXL DNA 高保真酶購自日本TaKaRa生物公司，PCR酶購自民賽生物 (廣州) 科技有限公司；Tet (四環素)、Amp (氨芐霉素) 購自生工生物工程 (上海) 股份有限公司；質粒提取試劑盒和PCR產物回收試劑盒購自Axygen公司；PCR引物為生工生物工程 (上海) 股份有限公司合成。

PCR擴增及鑒定引物：帶同源臂引物序列見表1，帶有下劃線的代表同源臂序列，不帶下劃線的代表PCR擴增引物序列；鑒定引物序列見表2。

表1 本研究所用帶同源臂引物

The single underlined sequences indicate homology arms.

表2 本研究所用鑒定引物

1.2 方法

1.2.1 甘油/甘露醇梯度[20]感受態的制備與電擊轉化

將過夜培養的大腸桿菌W3110等3個菌株按1∶100 (500 μL) 稀釋到50 mLSOB培養基中，30 ℃、180 r/min振蕩培養至600在0.4–0.6之間。然后冰浴30 min (含有pSim6質粒的菌株在42 ℃誘導15 min后冰浴30 min)。將上述培養液轉移至高壓滅菌處理的50 mL聚丙烯離心管中，4 ℃、5 500 r/min、7 min離心收集菌體，棄上清，加1 mL預冷的ddH2O重懸，再加15 mL ddH2O混勻，加15 mL甘油/甘露醇溶液伸到管底，緩慢加入，形成分層，4 500 r/min、6 min、4 ℃離心；重復3次后加1 mL 甘油/甘露醇溶液重懸于1.5 mL的EP管，6 500 r/min、4 min、4 ℃離心；后棄上清，加甘油/甘露醇溶液使總體積約為200 μL。取50 μL感受態與300 ng的打靶分子DNA片段進行電轉 (條件為電壓1.8 kV，電容25 μF，電阻200 ?)，立即用2 mL SOC培養基復蘇2 h。

1.2.2 線性雙鏈DNA介導的DNA重組

同源臂的設計遵循GC含量分布均勻且含量約為50%的原則，長度在35–50 bp最佳，本實驗擴增含同源臂的基因片段由同源臂長度為38 bp以及21 bp的擴增引物組成。使用高保真酶擴增，擴增條件是：98 ℃ 5 min；98 ℃ 10 s，55 ℃ 30 s，68 ℃ 1 kb/min (31個循環)；68 ℃ 10 min，4 ℃保溫。擴增的線性雙鏈DNA分子經純化回收后與感受態混合，進行電擊轉化。用含篩選標記 (Amp/Tet) 的LB平板或者其他條件 (42 ℃) 的LB平板篩選發生基因重組后的陽性克隆。

1.2.3選擇反選擇方法

①通過抗性基因進行正向選擇，PCR合成打靶分子 (兩側帶有同源臂的片段)，取約300 ng的回收產物與50 μL的感受態細菌混合，電擊轉化后復蘇2 h，涂于含Amp (25 μg/mL) 和 Tet (10 μg/mL) 的LB平板上，30 ℃培養過夜后篩選陽性克隆。②利用基因在42 ℃下的致死效應進行第二步反選擇篩選，使用基因為模板，通過高保真酶擴增兩側帶有同源臂的線性化DNA分子，擴增不同長度的外源片段 (500 bp，1 000 bp和2 000 bp)。試劑盒純化后取300 ng的回收產物與①中鑒定正確的50 μL陽性克隆感受態混合，電擊轉化后培養2 h，涂于無抗板 (200 μL菌液混合物) 在42 ℃過夜培養篩選。

1.2.4 重組克隆的鑒定

①選擇反選擇系統的鑒定：用各個位點的擴增上游引物 (lacIF、ackF、dbpaF和glkF) 與片段中的下游引物 (TetA-R) 進行PCR鑒定。②外源片段的鑒定：用外源基因片段中上游引物 (catjdF) 與各個位點的擴增下游引物 (lacIR、ackR、dbpaR和glkR) 進行PCR鑒定。用mix聚合酶鑒定，擴增條件是：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 kb/min (31個循環)；72 ℃ 10 min，4 ℃保溫。

1.2.5 重組效率的計算

從42 ℃無抗板各挑取23個單克隆與一個陰性克隆 (未轉外源片段的42 ℃平板) 進行PCR鑒定，通過瓊脂糖凝膠電泳分析，出現正確條帶的數目與總數的比值則為重組效率，重復3次取平均值。

2 結果與分析

2.1 ack位點的pSim6與kil聯用

基因 (GenBank登錄號: BAA16135.1) 是大腸桿菌基因組上的非必需基因，其表達乙酸激酶，它的缺失可使乙酸減少，增加谷氨酸的的產量[21]。因此我們在此位點用不同長度的外源片段進行替換。圖1A為重組后鑒定圖，然后從菌落表型 (圖1B、1C) 上可以觀察到：pSim6與聯用后與pKD46與聯用后相比較，空轉菌落數量差不多，轉cat500的外源片段，pSim6菌落數量相對較多；轉cat1k的外源片段，pSim6菌落數量與pKD46差異較為明顯；轉cat2k的外源片段，pSim6菌落數量與pKD46差異更為明顯。因此我們對pSim6質粒與聯用的重組克隆進行PCR鑒定，每次挑選23個，重復3次，圖1D為瓊脂糖凝膠電泳分析。圖1E為從圖1D得到的數據進行重組效率分析圖，圖中可以觀察到500 bp片段很容易被替換，重組率高達90%以上，長度增加至1 000 bp，重組率在71%–88%之間，外源片段為2 000 bp時，同源重組的重組率約為50%–94%。pKD46與聯用后的重組效率[18]分別為82.61% (500 bp)、47.83% (1 000 bp) 和13.04% (2 000 bp)。結果表明pSim6與聯用后比pKD46與聯用后的重組效率有明顯的提高。

圖1 ack位點的重組效率分析

2.2 lacI位點的pSim6與kil聯用

通過在位點進行不同片段同源重組后，pSim6質粒與兩者聯用，與pKD46質粒與聯用相比較，重組效率相對提高。對此，我們在其他非必需位點對pSim6質粒和反選擇系統聯用進行多基因位點驗證，觀察是否有同樣的重組效率。挑選了另外3個大腸桿菌非必需位點[22](GenBank登錄號: BAE76127.1)、[23](GenBank登錄號: BAA14946.1)、[24](GenBank登錄號: BAA16258.1) 進行分析。首先對基因位點進行分析，結果如圖2所示，用引物lacIF和tetA-R (末端序列) 鑒定長度為1 931 bp，證明成功得到陽性重組菌 (圖2A)。從圖2B中可以看到500 bp片段很容易被替換，重組率為85%–100%。長度增加至1 000 bp，重組率在60%–80%，外源片段為 2 000 bp時，同源重組的重組率約為50%–60%。

2.3 dbpa位點的pSim6與kil聯用

接下來對位點進行分析，用引物dbpaF和tetA-R (末端序列) 鑒定長度為1 833 bp，證明成功得到陽性重組菌 (圖3A)。同樣挑選23個單克隆與1個未轉外源片段單克隆作對照，用引物catjdF (外源片段上的基因序列) 與dbpaR擴增，瓊脂糖凝膠電泳并拍照觀察正確條帶。重復3次取平均值，結果如圖3C所示。從圖3B觀察到500 bp片段很容易被替換，重組率高達97%以上，長度增加至1 000 bp，重組率在82%–95%之間，外源片段為2 000 bp時，同源重組的重組率約為75%–82%。

圖2 lacI位點的重組效率分析

2.4 glk位點的pSim6與kil聯用

最后選擇了在非必需基因位點進行分析，用引物glkF和tetA-R (末端序列) 鑒定長度為1 969 bp，證明成功得到陽性重組菌 (圖4A)。同樣挑選23個單克隆與1個未轉外源片段單克隆作對照，用引物catjdF (外源片段上的基因序列) 與glkR擴增，瓊脂糖凝膠電泳并拍照觀察正確條帶。重復3次取平均值，結果如圖4B所示。從圖4C觀察到500 bp片段很容易被替換，重組率高達85%以上，長度增加至1 000 bp，重組率在63%–100%之間，外源片段為2 000 bp時，同源重組的重組率約為42%–84%。

圖3 dbpa位點的重組效率分析

圖4 glk位點的重組效率分析

3 討論

重組工程是一種應用廣泛的體內基因工程方法，它使DNA修飾變得簡單有效，并對其修飾時不需要限制性內切酶。Datta等[25]構建了一系列的重組質粒，pSim6是里面選擇強度較高的質粒。它是從pSim5質粒衍生出來的，來源于嚴緊型復制質粒pSC101，16個低拷貝數，在質粒中保留了Exo下游的天然tL3轉錄終止子，這可以防止Exo的過度轉錄產物進入區域。質粒中的Red重組系統在溫度敏感 (YS) 抑制因子CI857控制pL操縱子表達，在30–34 ℃下抑制因子有活性從而阻止pL操縱子表達，遏止Red重組酶的轉錄。溫度短暫升至42 ℃，阻遏物瞬時變性，啟動Red系統的表達；再回到低溫時，阻遏基因重新復制，結合pL操縱子，重新阻遏Red系統。在多次實驗中發現誘導42 ℃、15 min為高效表達Red重組酶的最佳條件[26]。相對比之前所用的pKD46質粒[19]，不需要誘導物 (L-阿拉伯糖) 的誘導，且選擇強度高，簡捷方便。

為了在基因組工程中為反選基因提供一種替代方法，在本研究中我們使用了一種新型的反選擇標記基因[27]。基因在低溫條件下 (如30 ℃)，pL被cI857抑制，從而抑制基因表達。當溫度升高至到42 ℃時，因為失活的cI857阻遏蛋白不能阻遏pL啟動子，啟動了基因的轉錄和表達，最終造成了宿主菌的死亡。在之前的研究[19]中已經對基因的選擇嚴謹性在3個大腸桿菌菌株的3個位點進行了分析，發現其選擇嚴謹性相對較高 (幾乎等同于tet-sacB選擇反選擇系統[28])。因此我們將pSim6質粒與基因聯合使用，在3個不同的大腸桿菌菌株W3110、MG1655和DH10B的4個非必需基因位點、、和進行重組效率分析。兩者聯用后，與研究中重組效率相比較，從而得出以下結果：外源片段500 bp重組效率兩者聯用與之前均很高，在80%以上；當外源片段增加至1 000 bp時，聯用后的重組效率約是之前基因的1.2–2倍；當外源片段增加至2 000 bp時，聯用后的重組效率約是之前基因的2.2–5倍。

兩者聯用后重組效率增長的原因是未知的。可能來自pSim6的多個cI拷貝在未誘導的情況下賦予對基因更高水平的調控，因此在42 ℃條件下蛋白可以高效表達進而有效地殺死宿主菌株。這種效率上的差異可能歸因于基因的更高的選擇嚴謹性。

隨著基因工程發展越來越快，基因編輯的方法日益增加。從而，本研究用含有高效的Red重組系統的pSim6質粒通過與新穎的反選擇系統這一技術融合，降低了反選擇標記的高背景，同時提高了對基因無痕修飾重組效率。雖然誘導性毒素系統[10]目前是反選擇系統中最好的一種，在一些條件下，的選擇嚴謹性比不上誘導型毒素系統的選擇嚴謹性，但是在該技術中不需要延長的孵育、特殊的試劑以及選擇性條件，基因除了有殺菌作用之外，還有抑菌的作用。這種思路在某些情況下還是有一定的優勢，向研究者提供了更多的方向和方法。為代謝工程和功能基因組的分析研究縮短了時間，提高了效率，使大腸桿菌的染色體改造更加便捷，從而推動了微生物科學的前進與發展。

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Combination of novel counter-selection systemand pSim6 plasmid in recombination engineering

Yujuan Li, Ruyi Chen, Mianfeng Yang, and Wei Chen

Guangdong Province Key Laboratory for Biotechnology Drug Candidates, School of Biosciences and Biopharmaceutics, Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou510006, Guangdong,China

Seamless modification is a popular genomic manipulation technique in genetic engineering. Selection stringency of the counter-selection system determines the efficiency of the seamless modification. Recently, a novel counter-selection system,, was constructed. It is reported that the selection selectivity ofis higher in host bacteria harboring plasmid pSim6 than that harboring pKD46, indicating that recombinants could be selected out more efficiently by combiningcounter-selection system and plasmid pSim6. In order to confirm this speculation, four different loci (,,,) instrains W3110, MG1655 and DH10B were selected for testing: dsDNA fragments of different sizes (500 bp, 1 000 bp, and 2 000 bp) were used to substitute. As expected, recombination efficiency was higher in host bacteria harboring plasmid pSim6 than that harboring pKD46, and the results were more obvious with the length of dsDNA increasing. Specifically, recombination efficiency was 1.2 to 2 fold higher in pSim6 harboring bacteria than in pKD46 harboring bacteria when dsDNA fragments were 1 000 bp in length. With the length of dsDNA increasing up to 2 000 bp, the gap increased to 2.2–5 fold. In conclusion, it is easier to perform seamless modification by combiningcounter-selection system and plasmid pSim6 than combiningand pKD46. An alternative tool in genomic engineering is provided in this study.

Red recombination system, selection/counter-selection system, seamless modification,

February 27, 2019;

May 20, 2019

Science and Technology Program of Guangdong Province (No. 2015A010107014), National Natural Science Foundation of China (No. 31501895).

Wei Chen. Tel: +86-20-39352201; E-mail:thinker98@163.com.

廣東省科技計劃項目 (No. 2015A01017014) 資助，國家自然科學基金 (No. 31501895)。

2019-06-28

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20190628.1331.002.html

李玉娟, 陳如意, 楊緬峰, 等. pSim6質粒與新型反選擇系統聯用在重組工程的應用. 生物工程學報, 2019, 35(9): 1761–1770.

Li YJ, Chen RY, Yang MF, et al. Combination of novel counter-selection systemand pSim6 plasmid in recombination engineering. Chin J Biotech, 2019, 35(9): 1761–1770.

(本文責編 陳宏宇)