磷銨兩性離子改性血管脫細胞支架可以有效體外抗血栓和內皮化

馮蘇，陳志鵬，劉澄，喬彤

磷銨兩性離子改性血管脫細胞支架可以有效體外抗血栓和內皮化

馮蘇，陳志鵬，劉澄，喬彤

南京醫科大學 鼓樓臨床醫學院，江蘇 南京 210000

由于自體血管(由同一受體的血管用于血管移植材料) 的有限可用性，以及非自體血管(人工制成的血管移植材料) 的生長能力不足，組織工程血管越來越受到重視。文中構建了一種磷銨兩性離子改性的血管脫細胞支架附以高度生物相容的骨髓源內皮祖細胞為內層的新型血管移植材料。通過一種簡便的方法——共沉淀法改性血管脫細胞支架，評價其體外血小板粘附實驗、溶血實驗、復鈣實驗和細胞毒性等相關指標。磷銨兩性離子改性后抗凝血活性提高，可以有效地促使類似于天然血管腔表面凹凸結構的脫細胞支架表面內皮祖細胞的附著。改性后的脫細胞支架具有與天然血管相似的力學性能，在體外可以有效地構建內皮化。研究結果為血管脫細胞支架通過改性實現體外抗血栓和內皮化方面進行了初步探索。

磷銨兩性離子，脫細胞支架，內皮化

目前我國心血管疾病逐年增多，雖然人工血管在外周動脈閉塞治療上為患者解決了很多問題[1]，但是移植物容易引起血栓形成、鈣化和新生內膜[2]。尤其小直徑 (<6 mm) 血管移植旁路手術中的增生嚴重，從而導致手術失敗[3]。盡管目前使用各種方法對血管脫細胞支架表面進行一定的修飾，但是由于細胞結構的缺乏還難以具備正常血管的生物活性或分泌功能[4]，因此長期通暢率低的現狀仍未克服[5]。如何增強抗血栓能力和抑制內膜增生是臨床血管移植面臨的挑戰。

血管組織工程學的發展為解決上述難題提供了新的研究途徑和解決方案[6]。由于脫細胞血管支架具備非常低的免疫源性，并且可以模擬自然狀態，那么在跟細胞相互的作用過程中將為其提供非常適宜生長的環境，這是一般材料所不具備的特點[7]。除了能提供細胞附著的架構支持外，還可以提供相應的生物線索，例如細胞粘附的位置[8]。去細胞化的細胞外基質是最接近自然狀態的支架，結合了獨特的微觀和宏觀結構。去細胞化的過程保持了結構的完整性，可以確保血管構架完整。由于這種多功能結構還具備誘導細胞分化和成熟的功能，因此可能成為生物支架制備的理想載體。盡管血管脫細胞支架取得了一定的成功，但是種子細胞種植脫細胞支架尚不理想，仍存在很多問題不能直接應用于臨床[9]。

具備抗凝血功能的生物材料的研究是目前研究的難點和熱點之一，也激發了相關工作者的研究熱情[10-12]。材料學方面的研究發現磷銨兩性離子 (Ammonium phosphate zwitterions，APZ) 具有明顯的抗凝和抑制血小板聚集的功能，是一種由疏水的非極性長碳鏈的羥基和親水的極性偶極離子構成的磷酰膽堿類化合物[13]，特殊的分子構成特點使其形成類磷脂雙分子層結構，相關的研究表明特殊的結構是抗凝和抗血小板特點的主要因素[14]?；谝陨峡紤]，以血管脫細胞支架為載體，APZ改性脫細胞支架后通過生物反應器將其內皮化培養構建成組織工程血管，檢驗其各項性能，以此實現一種新型的具備適宜內皮化、抗凝的組織工程血管，并最終應用于臨床。假設改性后的脫細胞支架能具備很好的生物相容性等功能，那么將為實現新型血管移植替代品的研發打下基礎，以解決目前臨床所面臨的困難。

1 材料與方法

1.1 材料

豬的頸動脈是從南京大學附屬鼓樓醫院實驗動物房新鮮豬尸體上解剖而來；實驗所需要的1% Triton X-100購自華美生物工程公司；十二烷基硫酸鈉購自阿拉丁試劑有限公司；磷酸鹽緩沖液 (PBS) 購自北京科學技術有限公司；HE染色試劑盒、多聚賴氨酸溶液和檸檬酸鈉緩沖溶液購自江蘇凱基生物技術股份有限公司；人骨髓來源內皮祖細胞購自上?？道噬锟萍加邢薰?。主要儀器：冷凍干燥機購自北京博醫康實驗儀器有限公司；Instron 5544力學檢測儀購自美國 Instron公司；JC2000C接觸角測量儀購自上海中晨數字技術設備有限公司；紫外可見分光光度計Lambda17購自美國PE公司；電熱扶風干燥箱購自上海圣欣科學儀器有限公司；掃描電子顯微鏡購自日本電子株式會社；倒置顯微鏡購自日本Olympus公司。

1.2 方法

1.2.1 制備血管脫細胞支架

具體步驟：1) 新鮮解剖的豬頸動脈在無菌的條件下浸入低溫生理鹽水中反復清洗，更換生理鹽水，直到生理鹽水清澈透明；2) 清洗徹底的血管放入1% Triton X-100和0.5%十二烷基硫酸鈉混合溶液中并在室溫條件下予以充分浸泡48 h；3) 浸泡后的血管取出后用PBS溶液反復清洗，清洗干凈后繼續浸泡于PBS溶液中維持30 d，放于低溫冰箱中每天換液2次；4) 在真空冷凍干燥箱(?75 ℃) 中冷凍干燥30 min，即制得血管脫細胞支架。

1.2.2 APZ改性血管脫細胞支架的制備

1) 將APZ溶解在50 mL的乙醇中并超聲30 min，使APZ的溶解能夠充分均勻。2) 將凍干后的血管脫細胞支架浸潤在PBS中30 min，取出后平放在一次性表面皿中。3) 上述材料稍干后，采用共沉降法將APZ溶液均勻地放在脫細胞支架的內外表面使其充分接觸。4) 將未作處理的血管脫細胞支架定義為對照組1，將APZ改性的脫細胞支架作為對照組2。

1.2.3 APZ改性血管脫細胞支架的物理性能檢測

1) 形態學觀察：改性后的脫細胞支架表面形態通過掃描電鏡來觀察，觀察前對樣本進行干燥和噴金處理。

2) 縫合撕裂強度的測定：將樣品裁剪為 5 mm×6 mm的矩形，厚度達0.25 mm。浸泡24 h后的待測試的樣品一端固定于測試儀，另一端則通過6-0Prolene線穿過樣品后連接于生物力學測試儀。調整兩端間距離為2 cm，以6 mm/min的速度牽拉兩端直至樣品完全斷裂。讀取斷裂時的數值，將獲取的樣品縫合撕裂強度數值和正常血管的縫合撕裂強度做對比。

3) 親水性測定：使用接觸角測量儀 (JC2000C)對改性脫細胞支架的液體接觸角進行測量，對樣本的不同位置進行6次測量，取其平均值。

1.2.4 血小板粘附實驗檢測

采用pH為7.4的PBS清洗脫細胞支架、改性脫細胞支架及人造血管后浸泡大約30 min，取出后放置超凈臺內進行充分干燥。取1 mL富血小板的浸沒樣品到24孔板中，振蕩時間約1 h，PBS沖洗數次之后用2.5%的戊二醛溶液進行固定，固定時間為30 min，然后再用PBS清洗干凈樣品，用50%、60%、70%、80%、90%和100%的乙醇溶液進行逐級脫水后放置超凈臺待其自然晾干。噴金后用QUANTA-200掃描電鏡對材料表面進行拍照。

1.2.5 體外溶血實驗檢測

含檸檬酸鈉抗凝劑的8 mL成人全血和10 mL濃度為0.9% NaCl水溶液進行混合稀釋。浸泡過PBS的脫細胞支架、改性脫細胞支架和人造血管分別放入10 mL 0.9% NaCl溶液中，在恒溫37 ℃條件下維持30 min，加入稀釋過的血液200 μL后充分搖勻，繼續37 ℃恒溫1 h，1 000 r/min離心10 min后取上清液，加入96孔板，用酶標儀 (BioTek Synergy2) 測定吸光度值 (值)，波長調整為545 nm。蒸餾水10 mL加稀釋血液0.2 mL作為對照組；0.9 % NaCl水溶液10 mL加稀釋血液0.2 mL作為陰性對照。平行試驗3組后取平均值。溶血率計算公式如下：

其中，D為陰性對照吸光度；D為陽性對照吸光度；D為試驗樣品吸光度。

1.2.6 體外復鈣實驗檢測

將脫細胞支架、改性脫細胞支架和人造血管分別置于PBS中浸泡后放置于96孔板中，然后將0.025 mol/L CaCl2溶液和貧血小板血漿 (Platelet-poor plasma，PPP) 各0.1 mL分別加入到96孔板中，使用酶標儀 (BioTek synergy2) 測量值，波長選擇為405 nm。0.1 mL的0.025 mol/L CaCl2溶液加0.1 mL的血漿作為對照組。實驗平行進行3次，最后取其平均值。

1.2.7 MTT法測體外細胞毒性

將脫細胞支架、改性的脫細胞支架以及人造血管剪成3 mm×3 mm的正方形備用。培養滿瓶的人EPCs去除培養液后加入0.25%的胰蛋白酶進行消化、吹打、離心。將人EPCs加入新培養液后稀釋成1×104cell/孔細胞懸浮液，采用96孔板進行實驗，按照100 μL/孔的量培養一段時間，使細胞增殖80%–90%左右再進行下一步實驗?？瞻讓φ战M、陰性對照組和試驗樣品組每組接種6孔，在放置于培養箱內 (37 ℃，5% CO2) 24 h和72 h后棄去培養液?？瞻讓φ战M采用MTT液，陰性對照采用細胞培養液，試驗組加入材料浸取液。96孔板中加20 μL (5 mg/mL) 的MTT溶液染色4 h后去除孔內液體，每孔再加入150 μL的二甲基亞砜 (DMSO) 溶液，在室溫下充分振蕩約10 min，用酶標儀在490 nm處測量吸光度值 ()，反復測量3次取平均值。材料的毒性程度可以通過RGR值的轉換直觀地表現出來，見表1。

表1 細胞毒性分級標準

具體公式為：

式中，D為陰性對照吸光度；D為空白對照吸光度；D為試驗樣品吸光度。

1.2.8 骨髓源內皮祖細胞 (Endothelial progenitor cells，EPCs) 培養構建內皮化

培養瓶經過高壓蒸汽滅菌放入超凈臺，輸送管道用75%乙醇灌注在超凈臺內消毒過夜，整個系統在超凈臺內進行組裝完成，并向組裝循環系統內注入無菌PBS液用來沖洗掉殘留的乙醇。將改性后的血管脫細胞支架置于培養系統中，一端進行結扎，另一端則與外界連接管相連；取細胞密度達到1×106/mL的EPCs細胞懸液1 mL，注入改性的脫細胞支架內，于37 ℃、5% CO2的環境下培養6 h后翻轉90°，按相同方法再次注入EPCs懸液；反復操作6次，注入細胞量約6×106，在飽和濕度的培養箱中繼續靜止孵育4 h后開啟蠕動泵，以1 mL/min的速度培養7 d。改性血管脫細胞支架血管內皮化檢測：分別培養1 d和7 d后，取出支架，行HE檢測和vWF特異性染色，觀察EPCs在血管內生長。

2 結果與分析

2.1 APZ改性脫細胞血管支架的物理性能測定

通過掃描電鏡觀察發現APZ改性脫細胞血管支架表面形態為納米纖維結構，排列無序。APZ改性脫細胞血管支架的大體外觀圖見圖1，圖2為SEM表面形態結構圖，而圖3為支架的HE 染色。

軟件分析SEM圖像，APZ改性脫細胞血管支架的納米纖維直徑分布在62–80 nm，平均為 (73.5±6.1) nm。與脫細胞支架和豬頸動脈并無明顯的不同。

APZ改性脫細胞支架抵抗縫線撕裂力的能力可以通過測量其縫合撕裂強度得出 (表2)。APZ改性脫細胞支架的縫合撕裂強度為 (4.4±0.6) N，強度要明顯好于單純脫細胞支架，與豬頸動脈相仿。

評估磷銨兩性離子改性脫細胞血管支架親水性可以通過測量支架膜表面的靜態水接觸角，得出APZ改性脫細胞血管支架具有較大的水接觸角，其表面表現為疏水性 (圖4，表2)。明顯要優于脫細胞支架和豬頸動脈。

進行綠色建筑設計，就一定要選用科學節能的建筑材料，對于高層民用建筑來講，設計者要注重材料的環保與節能性，盡量使用可以循環的材料，避免使用質量低劣、污染較高的材料，更不得采用國家和地方禁止和限制使用的建筑材料及制品。可以充分利用本地材料以及自然材料，這樣可以降低運費與資金，節省資源。另外，還可以回收一些廢棄物，可以對其中還有利用價值的材料進行重復利用，從而達到節能的效果。在具體設計時，可以簡化建筑的造型，且無大量裝飾性構件，只要將建筑設計得美觀大方即可，結構形式可以選擇混凝土結構、鋼結構等強度質量較高的結構體系進行設計。

2.2 血小板粘附

SEM圖5A為未改性的脫細胞支架，存在大量的血小板粘附，并且能夠看出血小板變形后伸出了偽足。SEM圖5B為人造血管血小板粘附實驗，可以看出少量的血小板粘附。SEM圖5C為APZ改性的脫細胞支架表面圖像，未見明顯的血小板粘附。由上述3張血小板粘附SEM圖可以看出，經過APZ改性得到的脫細胞支架材料可以抵抗血小板粘附，從而減少血小板對異體的排斥作用，是可以有效地提高材料的血液相容性。

圖1 APZ改性脫細胞血管支架大體觀

圖2 APZ改性脫細胞血管支架SEM圖

圖3 APZ改性脫細胞血管支架HE染色

圖4 APZ改性脫細胞血管支架接觸角(1S和10S)

表2 APZ改性脫細胞支架的生物學性能

APZ modified acellular vs. Acellular scaffold; APZ modified acellular vs. Porcine carotid artery (*<0.01; ns: no significance.).

圖5 血小板粘附掃描電子顯微鏡圖(×2 000)

2.3 溶血實驗

表3是脫細胞支架、人造血管和改性脫細胞支架的溶血試驗結果。根據表3的數據分析，APZ改性脫細胞支架材料的溶血率僅為0.6%，具有良好的血液相容性。生物醫用材料要求溶血率應小于5%，從數據上可以看出改性的脫細胞支架非常符合生物醫用材料的要求。

2.4 復鈣實驗

內源性凝血系統功能往往通過血漿復鈣實驗來評價。血漿中去除血小板后加入Ca2+使可溶性的纖維蛋白原轉化成可溶性纖維蛋白，而可溶性纖維蛋白則交聯成不溶物形成血栓。血液相容性越好則血漿凝固時間越長。記錄1/2max作為復鈣化凝血時間以此來評價凝血功能。

脫細胞支架、APZ改性脫細胞支架和人造血管的復鈣時間分別為10.2 min、18.1 min和15.9 min。APZ改性血管脫細胞支架材料復鈣時間比脫細胞支架和人造血管延長?？梢缘贸鯝PZ改性血管脫細胞支架材料延長了可溶性的纖維蛋白原轉化為可溶性纖維蛋白的時間，這也說明APZ改性脫細胞支架可以提高血液相容性。

表3 脫細胞支架的溶血試驗結果

2.5 MTT法測體外細胞毒性

APZ改性脫細胞支架和對照組1、2的細胞經過24 h和72 h的相對增殖率見表4。從表中可以看出無論是APZ改性脫細胞支架還是對照組其細胞毒性分級都為1級即無細胞毒性，表現了很好的細胞相容性。但APZ改性后的脫細胞支架72 h后細胞增殖率為93.4%，而對照組1、2分別為77.6%和75.7%，說明APZ改性后的脫細胞支架細胞增殖率明顯得到了提高。表明經APZ表面改性后的脫細胞支架表現出更好的細胞相容性。

2.6 骨髓源內皮祖細胞可以在APZ改性脫細胞血管支架上成功內皮化

組織工程血管培養過程中，第1天時可見少量細胞附著在改性脫細胞支架表面，HE染色可見有深染的細胞存在(圖6A)，表明細胞在第1天即可附著生長。第7天可見改性脫細胞支架表面大量細胞附著，可見細胞沿血管壁表面呈多層排列狀態生長(圖6B)，行組織切片HE染色可見大量細胞均勻地生長在改性脫細胞支架外層，細胞排列緊密。vWF是EPCs的特異性抗原，不論是在早期還是中期均有較高的表達。第1天時vWF免疫組化未見明顯特異性染色(圖6C)，在第7天時vWF免疫組化呈現明顯的特異性染色，考慮附著的細胞為EPCs，可以看出細胞大量生長，呈現多層排列狀態(圖6D)。通過循環灌注裝置的培養可以將EPCs種植在APZ改性脫細胞血管支架上，在7 d時可以觀察到EPCs成功分布于血管壁，緊密貼附，生長良好。

表4 細胞毒性分析

3 討論

組織工程目前在治療血管疾病研究方面，主要是通過手術將工程血管材料直接代替病變的血管。自體血管畢竟是有限的，小部分患者移植的血管為自體血管，而大部分患者使用的為各種人工血管。目前臨床上所使用的大口徑人工血管盡管近期通暢率高但是遠期通常率較差，而小口徑人工血管近期通暢率則比較低，限制了臨床應用[22]。血栓形成和不能有效地內皮化而導致的內膜增生是影響通暢率的主要因素[23]。臨床急需解決抗血栓抑制內膜增生的問題，這一方向的研究引發了血管組織工程學的進一步發展。為了改善材料的表面生物特性，又發展了各種表面接枝及修飾技術[24-25]，通過組織工程材料的改性，可以明顯提高細胞對工程材料的黏附和生長，以此來增加抗血栓和促進內皮化的實現。

細胞外基質參與生物體的新陳代謝，有著重要的功能，不僅維持著組織的結構而且連接組織中的實質細胞，還直接對實質細胞的形態、轉型以及分裂增殖起到一定的影響。最符合生物要求以及能夠模擬體內細胞外環境的生物材料應當是具備細胞外基質結構的脫細胞支架材料[26-27]，即去除了實質細胞保留了相對完整的細胞外骨架結構。脫細胞支架材料本身不僅具備接近天然血管的強度，而且其中的膠原纖維有利于內皮細胞的附著和提供了必要的生長環境；其中彈力纖維保留了血管的舒張和收縮功能，這兩種纖維結構的完整性為進一步的細胞種植起到了非常重要的作用。由于脫細胞支架去除了細胞的抗原性，極大地降低了免疫反應，避免了移植物的急性炎癥和免疫排斥劇烈反應的發生[28]。國內外相關動物實驗表明脫細胞支架材料具備很好的應用前景：3個月以上通暢率相當高，可高達80%–100%；實驗階段未觀察到明顯的瘤樣擴張、鈣化及局部感染情況的發生；具有種子細胞覆蓋和三維生長的外環境[29-30]。

APZ構建到醫用材料表面已被證實具有很好的抗凝血和生物相容性特點[31]，但尚未有應用到脫細胞支架的研究。將磷銨兩性離子共沉淀到脫細胞支架上，溶血實驗和復鈣化凝血時間實驗表明APZ改性得到的脫細胞支架材料具有良好的血液相容性。通過體外細胞毒性實驗表明改性的脫細胞支架具有較低的細胞毒性，完全符合生物材料的醫用要求。改性后的脫細胞支架材料在尺寸、制備方法、穩定性和相容性方面具備生物新型材料的特點，具有相當廣闊的應用前景。血小板粘附實驗表明改性后的脫細胞支架表面無明顯的血小板聚集，血小板基本無明顯變形，有呈單個粘附的孤立血小板存在，具備很好的血液相容性。細胞毒性實驗表明改性后的脫細胞支架無細胞毒性，具有非常好的細胞相容性；而各項物理特征檢測也表明改性后的脫細胞支架在力學性能和親水性方面要遠高于未改性前。以上實驗數據表明了改性后的脫細胞支架具備生物相容性高、抗凝能力強、力學性質好等特性。

理想的血管替代材料不僅要具備良好的機械性能，而且也要非常好的柔軟度和韌性；內皮細胞可根據溫度和血流的變化有相應的舒縮反應，并能根據外部環境的變化和生物體的需要分泌生物活性物質，以便保持血管長期通暢而不形成血栓[32-33]。因此對于血管替代材料應該具有完整的內皮細胞結構[34]，從而達到長期的通暢目的[35]。

內皮祖細胞 (EPCs) 在血管新生過程中起著相當重要的作用，是血管內皮細胞的干細胞[36]。近十年的研究發現表明，成熟血管內皮細胞移植后不能整合進血管發生部位，即不能參與血管的修復與重塑。正常人外周血中存在著微量的EPCs分化的成熟內皮細胞[37]，EPCs誘導分化成內皮細胞符合生理。離體擴增培養法主要從骨髓、臍帶血以及成人外周血中收集EPCs，是獲取EPCs的主要來源。應用EPCs構建組織工程血管目前已成為研究的熱點，在體內外實驗中都已證實EPCs具有血管內皮細胞的分化潛能，雖然尚未在臨床上成功模擬血管組織誘導，但是EPCs的分化潛能已得到了充分的肯定，其分化潛力在不斷開發中[38-40]。骨髓中獲取EPCs更為方便，為APZ改性血管脫細胞支架材料內皮化創造了有利條件。

構建血管組織工程支架的最終目標是構建出具備生物功能的可供移植的血管組織。通過EPCs體外培養種植于APZ改性脫細胞支架獲得成功，表明該APZ改性血管脫細胞支架與人EPCs有良好的生物相容性，此部分研究為進一步構建和驗證組織工程血管提供了實驗基礎。

以上研究表明，通過血管脫細胞支架的APZ改性，可以保持原有血管的物理性質，增加了疏水功能，成功構建了骨髓源EPCs內皮化，具備了移植的條件。主要得出了以下結論：1) APZ改性得到的脫細胞支架材料未見血小板粘附，保留了抗血栓的特性。說明APZ將減少血小板對異體的排斥反應，從而提高了材料的血液相容性。2) APZ改性得到的脫細胞支架材料的溶血率明顯小于生物醫用材料要求的5%，表明改性后的材料本身具有良好的血液相容性。3) APZ改性血管脫細胞支架材料延長了可溶性的纖維蛋白原轉化為可溶性纖維蛋白的時間，表現出更好的血液相容性。4) 經APZ表面改性的脫細胞支架無細胞毒性，表現出很好的細胞相容性。5) APZ改性血管脫細胞支架抵抗縫線縫合的撕裂力和天然動脈相仿，增加了疏水功能。6) 通過培養裝置成功實現了人骨髓源EPCs內皮化，為最終臨床應用奠定了實驗基礎。

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Acellular vascular scaffolds modified by ammonium phosphate zwitterionscan effectively resist thrombosis and promote endothelialization

Su Feng, Zhipeng Chen, Cheng Liu, and Tong Qiao

Drum Tower Clinical Medicine College, Nanjing Medical University, Nanjing 210000, Jiangsu, China

Due to limited availability of autologous blood vessels (blood vessels from the same recipient used for vascular transplantation materials) and inadequate growth ability of non-autologous blood vessels (artificial blood vessel transplantation materials), more and more attention has been paid to tissue engineering blood vessels. In this study, we constructed an ammonium phosphate zwitterion modified acellular vascular scaffold with highly biocompatible bone marrow-derived endothelial progenitor cells as the inner layer of a new vascular transplantation material. The vascular acellular scaffolds were modified by a simple method—co-precipitation method.The platelet adhesion test, hemolysis test, recalcification test and cytotoxicity of acellular vascular scaffoldswere evaluated. Ammonium phosphate zwitterions modified endothelial progenitor cells on the surface of acellular scaffolds with concave and convex structure on the surface of natural vascular lumen can be effectively promoted by improving anticoagulant activity. Modified acellular scaffolds have similar mechanical properties to natural blood vessels and can effectively construct endothelialization. The results of this study provide a preliminary exploration for the modification of vascular acellular scaffolds to achieve anti-thrombosis and endothelialization.

ammonium phosphate zwitterions, acellular scaffolds, endothelialization

February 17, 2019;

April 28, 2019

National Natural Science Foundation of China (No. 81370387).

Tong Qiao. Tel: +86-25-83106666; E-mail: qiaotongmail@nju.edu.cn

馮蘇, 陳志鵬, 劉澄, 等. 磷銨兩性離子改性血管脫細胞支架可以有效體外抗血栓和內皮化. 生物工程學報, 2019, 35(9): 1750–1760.

Feng S, Chen ZP, Liu C, et al. Acellular vascular scaffolds modified by ammonium phosphate zwitterions can effectively resist thrombosis and promote endothelialization. Chin J Biotech, 2019, 35(9): 1750–1760.

國家自然科學基金 (No. 81370387) 資助。

(本文責編 陳宏宇)