小麥翻譯控制腫瘤蛋白TCTP與蔗糖非酵解型蛋白激酶SnRK1的相互作用

麻楠，喬金柱，湯文倩，孫天杰，劉娜，陳琰，路興通，韓勝芳，王冬梅

小麥翻譯控制腫瘤蛋白TCTP與蔗糖非酵解型蛋白激酶SnRK1的相互作用

麻楠，喬金柱，湯文倩，孫天杰，劉娜，陳琰，路興通，韓勝芳，王冬梅

河北農業大學 生命科學學院 河北省植物生理與分子病理學重點實驗室，河北 保定 071001

翻譯控制腫瘤蛋白 (Translationally controlled tumor protein, TCTP) 廣泛存在于真核細胞中，參與調節細胞分裂、植物生長發育，并介導植物抵御病原物侵染。蔗糖非酵解型蛋白激酶 (SNF1- related protein kinase, SnRK1)在酵母、動物和植物中非常保守，并參與包括糖代謝和抵抗非生物和生物脅迫在內的一系列生理過程。本實驗室前期工作證明TaTCTP響應葉銹菌侵染并參與誘發寄主產生防衛反應。為了深入探討TaTCTP在葉銹菌侵染小麥誘發的防衛反應中發揮的作用，采用串聯親和純化 (TAP) 與質譜 (MS) 聯用技術，鑒定出SnRK1可能為TaTCTP潛在互作蛋白。文中對TCTP和SnRK1的相互作用進行了研究。酵母雙雜交結果表明，同時攜帶TCTP和SnRK1的酵母可以在SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade (SD/-LWHA, 四缺) 培養基上生長，說明TCTP與SnRK1在酵母雙雜交系統中可以發生相互作用；通過雙分子熒光互補實驗，發現TCTP與SnRK1發生相互作用的熒光信號分布在細胞質中；進一步用Co-IP實驗證明TCTP和SnRK1可以發生相互作用。本研究為深入研究TaTCTP在小麥與葉銹菌互作過程中的作用機制奠定了重要基礎，對進一步完善小麥抵御葉銹菌侵染的分子機理具有重要意義。

翻譯控制腫瘤蛋白，蔗糖非酵解型蛋白激酶，酵母雙雜交，雙分子熒光互補，免疫共沉淀

翻譯控制腫瘤蛋白是一類保守且廣泛存在于真核細胞中的蛋白質[1]。自1981年從小鼠成纖維細胞中發現并鑒定以來[2]，TCTP被認為具有廣泛的生物學功能，包括抑制細胞凋亡[3]、參與組胺的釋放[4]、調控細胞周期與細胞分化[5]、參與修復DNA損傷[6]等。在植物中，TCTP影響細胞的生長[7]、響應乙烯信號[8]、降低重金屬汞誘導的活性氧 (ROS) 對組織的傷害[9]。此外，有報道指出，TCTP響應胡椒黃花葉病毒PepYMV的侵染[10]、小麥白粉菌的侵染[11-12]和小麥葉銹菌的侵染[13]，說明TCTP在植物與病原菌互作過程中可能發揮重要作用。

小麥是重要的糧食作物，小麥在其生長周期常受到多方不利因素的影響，其中，由小麥葉銹菌侵染引起的小麥葉銹病是危害小麥生產的嚴重病害。已有報道，在小麥抵御條銹菌侵染的過程中TCTP發揮重要作用，采用病毒誘導的基因沉默 (Virus induced gene silencing, VIGS) 技術沉默小麥中的，很大程度地降低了植株對條銹菌的抗性[14]。本課題組前期實驗證明，在由小麥抗葉銹近等基因系Tc和葉銹菌生理小種366組成的不親和組合中，的轉錄水平在測定范圍內隨接種時間的延長呈現逐漸增加的趨勢，但其在蛋白水平并無明顯變化[13]。為了進一步研究TCTP在小麥抵御葉銹菌侵染誘發的防衛反應過程中的作用機制，完善植物抗病信號轉導網絡，本課題組前期借助串聯親和純化-質譜鑒定 (TAP-MS) 技術，建立了TCTP在小麥-葉銹菌互作過程中的潛在互作蛋白庫，從中發現了一個與TCTP潛在互作的蛋白即蔗糖非酵解型蛋白激酶1 (SNF1- related protein kinase, SnRK1)。

SnRK最先發現于酵母中，由于缺失該基因的酵母突變體不能夠利用無葡萄糖培養基中的甘油和乙醇等碳源，故該突變體命名為(Sucrose non-fermenting 1)[15]。在動物中的SnRK被命名為AMPK (AMP-activated protein kinase)，得名于該蛋白受細胞內AMP/ATP比例的升高而激活[16]。植物中的SnRK分為3個亞族[17]，SnRK2、SnRK3/CIPK為植物特有，而SnRK1則與酵母SNF1和哺乳動物AMPK高度同源[18]。SnRK1通常在細胞能量不足的情況下被激活，并抑制諸多生物合成反應以及植物生長[19-23]。SnRK1被認為參與生長發育、非生物脅迫應答以及疾病防御在內的多種生物學進程。例如，擬南芥SnRK1可磷酸化轉錄因子bZIP63，改變后者的二聚化狀態，從而通過影響bZIP63對下游基因的表達調控而應答饑餓脅迫[24]。Kim等報道了一種SnRK1家族的蛋白AKIN10，可以通過磷酸化乙烯受體EIN3而延遲乙烯促進的植物器官衰老[25]。另有報道，AKIN10還可以通過磷酸化作用下調AtMYC2介導的鹽脅迫耐受能力[26]。小麥SnRK1還可以與TaFROG相互作用，介導植物對真菌病原禾谷鐮刀菌的抗性[27]。鑒于目前對TCTP和SnRK1的研究進展，結合本實驗室對TCTP在小麥與葉銹菌互作過程中功能研究的初步結果，本研究借助酵母雙雜交、雙分子熒光互補實驗和Co-IP進一步驗證二者間的相互作用，明確二者發生相互作用的細胞部位，對進一步研究TCTP和SnRK1在小麥與葉銹菌互作過程中的功能，豐富和完善小麥抗葉銹病機制具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 植物材料培養

小麥抗葉銹近等基因系Tc與本生煙草為本課題組長期保存。

小麥種植后，生長至第一片葉完全展開后，接種小麥葉銹菌生理小種260，小麥的種植條件和葉銹菌的接種采用Qiao等[28]的方法。本生煙草在溫室中生長21 d左右，至4–5片葉完全展開時進行瞬時表達實驗，具體種植條件參照Sparkes等的方法[29]。

1.2 實驗中所用引物

本實驗所涉及的引物及其名稱和用途見表1。

表1 引物信息

1.3 基因克隆

將葉銹菌生理小種260接種于小麥葉片表面，48 h后取接種葉片并在液氮中速凍，打碎材料后提取總RNA，并將其反轉錄為cDNA。采用引物TCTP F/R擴增編碼區全長 (長度為507 bp)，利用引物SnRK1 F/R擴增的編碼區全長 (長度為1 503 bp)，并分別連接至克隆載體pEASY-T1上，藍白斑篩選后，測序由北京華大基因股份有限公司完成。

1.4 酵母雙雜交載體構建

為了獲得用于構建酵母雙雜交載體的和開放閱讀框序列，分別采用引物Y2H TCTP F/R和Y2H SnRK1 F/R進行擴增。因其酶切位點與基因之間無保護堿基，這兩個基因分別與其在最終載體中上游的Active domain和Binding domain處于相同的開放閱讀框。將擴增產物進行電泳并切膠回收，采用RⅠ和HⅠ進行雙酶切后，與同樣經雙酶切的載體pGADT7-AD和pGBKT7連接，將其轉化大腸桿菌TOP10菌株。對得到的單克隆進行PCR鑒定，測序由北京華大基因股份有限公司完成。在測序時，pGADT7-AD-和pGADT7-AD-使用通用引物T7和3AD，pGBKT7-和pGBKT7-采用通用引物T7和3BD，所得測序結果可用DNAMAN軟件進行比對分析。

1.5 酵母雙雜交

使用PEG/LiAc法轉化酵母AH109。實驗組為pGBKT7-和pGADT7-AD-共轉化、pGBKT7-和pGADT7-AD-共轉化，以pGADT7和pGBKT7空載體共轉化作對照。為了檢測兩個基因的自激活活性，以pGBKT7-和pGBKT7-載體分別與pGADT7-AD空載體共轉化。將轉化后的酵母分別涂在SD/-Leu/-Trp (SD/-LW, 二缺)平板培養基上，放置28 ℃培養箱中培養3?4 d。然后挑取單菌落至SD/-LW液體培養基中振蕩培養，直至600≈0.5，取5 μL菌液并分別滴在SD/-LW、SD/-Leu/-Trp/-His (SD/-LWH, 三缺)和SD/-LWHA平板培養基上，在28 ℃培養箱中培養5 d，相機拍照后記錄結果。

使用ONPG法[30]對酵母的基因活性進行檢測。將滅菌后的濾紙在長出菌落的SD/-LW培養基上影印，將濾紙經液氮反復凍融10次，置于干凈的培養皿中。在濾紙上滴加含有20 mg/L X-Gal的Z-Buffer (16.1 g/L Na2HPO4·7H2O、5.5 g/L Na2HPO4·H2O、0.75 g/L KCl、0.246 g/L MgSO4·7H2O)，避光、30 ℃靜置5 h，拍照記錄。

1.6 雙分子熒光互補載體的構建

為了獲得用于構建雙分子熒光互補載體的和開放閱讀框序列，使用引物BiFC TCTP F/R和BiFC SnRK1 F/R分別進行擴增，酶切位點與基因之間無保護堿基，使這兩個基因分別與其在最終載體中上游的和處于相同的開放閱讀框。將擴增產物進行電泳后回收，經HⅠ和Ⅰ雙酶切后，與同樣經雙酶切的載體pSPYNE和pSPYCE進行連接，轉化大腸桿菌TOP10菌株。使用片段擴增用引物分別對連pSPYNE-和pSPYCE-單克隆進行PCR鑒定，測序由北京華大基因股份有限公司完成，使用DNAMAN軟件對測序結果進行比對 分析。

1.7 雙分子熒光互補實驗

采用瞬時表達法，將攜帶有相互作用蛋白基因的質粒在煙草葉片中表達[29]。對分別攜帶有pSPYNE-、pSPYCE-、pSPYNE-和pSPYCE-質粒的農桿菌GV3101進行單克隆培養，600值約為0.8時，5 000×離心3 min后富集菌體，所得菌體用無菌水洗滌，再用煙草侵染緩沖液 (9.76 g/L MES、0.76 g/L Na3PO4·12H2O、5 g/L 葡萄糖、0.1 mmol/L AS) 重懸菌體。將攜帶有pSPYNE和pSPYCE的農桿菌按照表2的組合混合，例如：第1組為pSPYNE和pSPYCE-混合，第5組為pSPYNE-和pSPYCE-混合，兩種菌液的混合比例為1∶1，并在煙草葉片下表皮注射。48 h后取煙草葉片，使用激光掃描共聚焦顯微鏡 (FV1000，奧林巴斯) 在488 nm觀察并 照相。

1.8 Co-IP植物表達載體的構建

本研究涉及的免疫共沉淀 (Co-IP) 實驗所需載體均以pCAMBIA3301為背景骨架進行構建。pCAMBIA3301帶有受CaMV 35S啟動子驅動的GUS基因，在GUS基因的上下游分別有Ⅰ和E Ⅱ酶切位點。以引物BV-TCTP F/R擴增CDS區全長，并經過Ⅰ和E Ⅱ酶切后連接至pCAMBIA3301載體上。使用引物BV-SnRK1 F/R對去掉終止密碼子的CDS區全長進行擴增，以Ⅰ酶切，并連接至載體pCAMBIA3301-。對連接產物轉化大腸桿菌，以硫酸卡那霉素篩選，經過菌落PCR鑒定、酶切鑒定和測序驗證后，可以分別得到受CaMV 35S啟動子驅動的基因植物表達載體和受CaMV 35S啟動子驅動的融合表達載體。

表2 BiFC實驗所用的農桿菌組合攜帶的基因

1.9 Co-IP實驗

免疫共沉淀是驗證蛋白質相互作用的經典技術，本實驗所用的Co-IP方法參考Mair等的研究[24]。將攜帶和(或) 表達載體的農桿菌組合注射煙草下表皮，48 h后取材并液氮研磨。使用冰上預冷的RIPA緩沖液提取總蛋白，并在蛋白中加入Anti-Flag Mouse monoclonal antibody (稀釋度1∶500) 捕獲標簽蛋白。在捕獲后的蛋白提取液中加入Protein A/G agarose，并離心收集。在Protein A/G agarose中加入2×蛋白上樣緩沖液并煮沸，經10% SDS-PAGE分離后，轉膜進行Western blotting檢測，一抗為Anti-GFP Mouse monoclonal antibody (稀釋度1∶2 000)，使用ECL發光檢測抗體分布并以X光片成像。

2 結果與分析

2.1 酵母雙雜交載體的構建

酵母雙雜交載體以pGADT7-AD和pGBKT7為載體骨架，使用酶切-連接法構建。使用引物Y2H-TCTP F/R擴增編碼區全長，使用引物Y2H-SnRK1 F/R擴增編碼區全長。分別和克隆載體連接，后將酶切正確的克隆產物進行測序鑒定。鑒定正確的克隆產物和表達載體pGADT7-AD和pGBKT7分別經RⅠ和HⅠ雙酶切，將基因片段和載體片段回收，并分別進行連接、轉化大腸桿菌。酶切驗證結果表明在約為507 bp和1 503 bp處檢測到DNA片段 (圖1)，片段長度與和的預期序列長度相同，表示載體構建成功。

2.2 雙分子熒光互補載體的構建

雙分子熒光互補載體以pSPYNE和pSPYCE為載體骨架，使用酶切-連接法構建，與酵母雙雜交載體構建的過程類似。使用引物BiFC-TCTP F/R擴增TaTCTP編碼區全長，使用引物BiFC-SnRK1 F/R擴增TaSnRK1編碼區全長。連接克隆載體后測序鑒定。將鑒定正確的克隆與表達載體pSPYNE和pSPYCE分別經HⅠ和Ⅰ雙酶切，并分別連接、轉化大腸桿菌。酶切鑒定結果顯示，與酶切前比較分別在約為507 bp和1 503 bp處檢測到DNA片段 (圖2)，與和的預期序列長度一致，表示載體構建成功。

圖1 酵母雙雜交載體的驗證

2.3 免疫共沉淀植物表達載體的構建

Co-IP實驗選擇的植物表達載體骨架為pCAMBIA3301，該載體為典型的植物雙元表達載體，可在轉基因植株中表達草胺膦乙酰轉移酶(Phosphinothricin acetyltransferase, PAT)和GUS。本實驗以Ⅰ和E Ⅱ將GUS基因切下，并連接所需的片段，從而使目的片段受原基因上游的CaMV 35S啟動子調控。此外，對于連接有基因的pCAMBIA3301-載體，使用Ⅰ將載體線性化，并連接基因的開放閱讀框，開放閱讀框下游的終止密碼子“TGA”被去掉，以實現和下游基因的融合表達。上述兩個載體在連接后，分別使用NcoⅠ/EⅡ和Ⅰ酶切鑒定。酶切后的pCAMBIA3301-和pCAMBIA3301--均可以檢測出和預期分子量大小的條帶 (圖3)，表示載體構建成功。

圖2 雙分子熒光互補載體的驗證

2.4 TCTP與SnRK1相互作用的酵母雙雜交檢測

本研究的酵母雙雜交使用GAL4轉錄因子拆分系統，該系統具有4個報告基因，分別以、、和對應組氨酸缺陷互補、腺嘌呤缺陷互補、α-半乳糖苷酶和金擔子素A抗性[31]，本研究檢測了前3個報告基因的活性。結果顯示 (圖4)，共同轉化攜帶和開放閱讀框質粒的酵母可以在SD/-LWH和SD/-LWHA培養基上生長，說明和報告基因被激活。將攜帶和開放閱讀框的pGBKT7質粒單獨轉化酵母，發現酵母不能在SD/-LWH和SD/-LWHA培養基上生長，說明和基因不具有自激活活性。

圖3 Co-IP植物表達載體的驗證

將凍融破碎細胞的酵母經X-α-Gal顯色，結果顯示共同轉化攜帶和開放閱讀框質粒的酵母印記為藍色，說明報告基因被激活。以上結果說明TCTP與SnRK1在酵母中發生了相互作用。

2.5 TCTP與SnRK1相互作用的雙分子熒光互補實驗檢測

將攜帶和開放閱讀框序列的pSPYNE和pSPYCE載體單獨或共同注射煙草葉片的下表皮細胞，然后在激光掃描共聚焦顯微鏡下對轉化后的細胞進行觀察并成像。結果顯示，單獨轉化或的煙草均不能觀察到熒光，而兩個基因共同轉化的煙草可以觀察到很強的熒光信號，并且二者發生相互作用產生的熒光信號主要分布在細胞質中 (圖5)。這一結果表明，TaTCTP和TaSnRK1可以在植物細胞內發生相互作用，并且二者的相互作用主要發生在細胞質中。

2.6 TCTP與SnRK1相互作用的Co-IP檢測

為了檢測TCTP和SnRK1在植物細胞內的互作情況，本研究以TCTP為誘餌蛋白釣取該蛋白的相互作用蛋白，并使用Western雜交檢測釣取的蛋白中是否含有SnRK1。為了避免煙草中本底表達的TCTP或SnRK1同源蛋白對本實驗造成干擾，提高檢測的特異性，將二者均與蛋白標簽融合表達，分別產生Flag-TCTP和SnRK1-GFP融合蛋白。上述兩個融合蛋白為本實驗的檢測組，將Flag-TCTP和GFP混合注射的蛋白樣品作為對照組，以排除TCTP和GFP標簽發生相互作用的可能性。在Input樣品中，可以檢測出Flag-TCTP和SnRK1、GFP的條帶，表示3種蛋白都存在于待檢測樣品中 (圖6)。在IP樣品中，使用Flag抗體釣取的蛋白中可以用GFP抗體檢測到SnRK1-GFP融合蛋白的條帶，表示TCTP可以與SnRK1在植物細胞內相互作用。在對照組中未檢出GFP條帶 (圖6)，表示Flag-TCTP和SnRK1-GFP的相互作用是特異性的，并非由前者和GFP蛋白標簽結合引起。

圖4 酵母雙雜交檢測TaTCTP和TaSnRK1的相互作用

圖5 雙分子熒光互補實驗檢測TaTCTP和TaSnRK1在煙草葉片表皮細胞中的相互作用

圖6 TaTCTP和TaSnRK1相互作用的Co-IP檢測

3 討論

高等植物進化出了多條免疫途徑來抵御病原物的侵染，其中病原菌侵染誘發的超敏性反應——細胞程序性死亡 (HR-PCD) 是植物抵御活體寄生真菌病原的主要途徑之一[32]。本課題組前期實驗證明，HR-PCD是小麥抵御葉銹菌侵染的重要防衛反應[33]。目前已知有多種信號分子參與調控小麥-葉銹菌互作中HR-PCD的發生和擴展，包括Ca2+、NO和H2O2，且Ca2+信號位于H2O2和NO的上游，對HR-PCD進程起了決定性的調控作用[28]。然而，該信號分子通過何種途徑調控HR-PCD，目前尚無定論。本課題組前期借助EGTA螯合胞外Ca2+，并進行轉錄組分析，以期發掘HR-PCD發生過程中Ca2+下游的調控基因[34]，發現TCTP在Ca2+的下游發揮作用。并且，在小麥近等基因系Tc與葉銹菌生理小種366組成的不親和組合中，在轉錄水平響應葉銹菌侵染[13]。

為了闡明TCTP在葉銹菌侵染小麥誘發的HR-PCD過程中的分子機制，本課題組前期借助TAP-MS技術對小麥接種葉銹菌后TCTP的互作蛋白進行了鑒定，并對TCTP與索馬甜類蛋白 (Thaumatin-like protein, TLP) 間的相互作用進行了驗證[35]，為進一步深入研究TLP作為一類重要的病程相關蛋白成員，在小麥抵御葉銹菌侵染的防衛反應過程中的作用機制奠定了基礎。蛋白質的磷酸化修飾是細胞信號轉導的重要調控方式，TCTP也已被認為可參與HR-PCD發生的調控過程[36]。與TCTP互作的蛋白激酶很可能是葉銹菌誘發小麥發生HR-PCD的分子調控網絡的關鍵節點。目前對SnRK1的研究表明，它是一個蛋白激酶復合物，其中a亞基是它的催化亞基，β和g亞基是調節亞基[37]，SnRK1參與植物生長和發育等諸多生物學過程，尤其對淀粉的降解和合成具有重要調節作用[38]。另外SnRK1也參與調控植物抵抗病原菌侵染的作用，如SnRK1可以作為孤兒蛋白TaFROG的互作因子，共同響應小麥抵御禾谷鐮孢菌的侵染過程[27]。水稻SnRK1過表達植株的正常生長發育受阻，增強了水楊酸和茉莉酸途徑介導的防御反應，并增加了對半活體營養型和死體營養型病原菌的抵抗力，而該基因的沉默則增加了對這些病原物的敏感性[39]。馬鈴薯病毒Y的HC-Pro組分可以和StubSNF1 (一種SnRK1家族成員)的調節亞基StubGAL83相互作用，并下調后者的表達，從而瓦解植株抗性，積累更多的病毒RNA[40]。因此本研究對TCTP與SnRK1互作關系的鑒定可以促進對小麥-葉銹菌互作過程中TCTP調控HR-PCD擴展分子機制的深入研究。此外，經過與Perochon等[27]研究中SnRK1序列進行比對分析，本研究涉及的SnRK1為其構成同源蛋白復合體的a亞基。

本研究使用了3種檢測蛋白質相互作用的方法，即酵母雙雜交、雙分子熒光互補和免疫共沉淀。TaTCTP定位于細胞核和細胞質中，而TaSnRK1定位在細胞質中，并且兩者均不含有跨膜結構，因此適用于GAL4轉錄因子酵母雙雜交系統[41]。本研究在經過酵母雙雜交驗證二者間存在物理互作后 (圖4)，又通過雙分子熒光互補實驗進一步確證了二者的互作關系，且證明二者的互作發生在細胞質中 (圖5)。雙分子熒光互補實驗也有若干體系，其中常用的有黃色熒光蛋白拆分系統 (Spilt YFP system) 和熒光素酶拆分系統 (Spilt luciferase system)[42]。熒光素酶拆分系統適用于檢測蛋白質間發生弱互作的檢測，并且可以從活體水平上進行[43]。黃色熒光蛋白拆分系統則可以從亞細胞水平進行觀察，分析蛋白質發生相互作用的位置[44]。這對蛋白質相互作用的復合物功能研究具有重要意義。本研究使用黃色熒光蛋白拆分系統的BiFC，發現TCTP和SnRK1的相互作用發生在細胞質中，這與我們之前對TCTP和TLP相互作用研究的結果相似。雖然TCTP具有在細胞核中的定位，但TCTP和SnRK1的相互作用并不發生在細胞核中，暗示二者形成的復合物可能參與葉銹菌侵染小麥誘發的HR-PCD過程中胞質內信號的傳遞過程。

在Co-IP實驗中Rubisco大亞基通常可以非特異性地與抗體結合，在約51 kDa的位置產生干擾信號，用于IP的抗體也會混合在樣品中，并被二抗檢測到，抗體的重鏈 (Heavy chain, HC) 會在約55 kDa的位置產生干擾信號。上述兩種來源的干擾會對SnRK1的檢出造成干擾，后者的預測相對分子質量為57 kDa。因此，本研究在Co-IP實驗的設計中，將SnRK1與GFP融合表達，融合蛋白的預測相對分子質量約為84 kDa (圖6)，在避免其他蛋白對結果干擾的同時，利用GFP標簽抗體本身的高特異性可以很好地保證檢測的靈敏度。盡管本實驗明確了TCTP與SnRK1的互作關系，但二者在葉銹菌侵染小麥誘發的HR-PCD過程中的具體功能仍不清楚，還需要利用遺傳學手段對二者在細胞信號轉導的上下游關系進行研究，明確二者發生相互作用的具體生理功能，進而完善小麥響應葉銹菌侵染誘發的HR-PCD發生的分子調控網絡。

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Interaction between wheat translationally controlled tumor protein TCTP and SNF1-related protein kinase SnRK1

Nan Ma, Jinzhu Qiao, Wenqian Tang, Tianjie Sun, Na Liu, Yan Chen, Xingtong Lu, Shengfang Han, and Dongmei Wang

Key Laboratory of Hebei Province for Plant Physiology and Molecular Pathology, College of Life Sciences, Hebei Agricultural University, Baoding 071001, Hebei, China

Translationally controlled tumor proteins (TCTP) and SNF1- related protein kinase (SnRK1) are conserved and widely present in eukaryotic cells. TCTP regulates cell division, plant growth and development, and mediates plant resistance against pathogen infection. SnRK1 participates in a range of physiological processes including sugar metabolism and resistance to abiotic and biotic stresses. Previous work in our laboratory demonstrated that wheat TCTP can respond toinfection and induce host defense responses. In order to further investigate the mechanism of TaTCTP in wheat resistance toinfection, we used TAP (tandem affinity purification) and mass spectrometry to screen the potential interactants of TaTCTP. A SNF1- related protein kinase (SnRK1) was identified as a potential interacting protein of TaTCTP. The results of yeast two-hybrid assay showed that TCTP could interact with SnRK1 in yeast, and the yeast carrying TCTP and SnRK1 could grow on SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade (SD/-LWHA) medium. The fluorescence signal of the interaction between TCTP and SnRK1 was found to be distributed in the cytoplasm in the Bi-fluorescense complementation experiment. Co-IP experiments further showed that TCTP and SnRK1 could interact in plant cells. This study lays an important foundation for further studying the mechanism of TaTCTP in the interaction between wheat and, and it play a great influence on further improving the molecular mechanism of wheat resistant to.

translationally controlled tumor proteins, SNF1- related protein kinase, yeast two hybrid, BiFC, Co-IP

January 31, 2019;

June 10, 2019

Hebei Innovation Funding Program for Doctoral Candidates (No. CXZZBS2019103), National Natural Science Foundation of China (Nos. 31171472, 31871548).

s: Shengfang Han. Tel: +86-312-7528276; E-mail: hansf123@163.com

Dongmei Wang. Tel: +86-312-7528276; E-mail: dongmeiwang63@126.com

河北省博士研究生創新項目 (No. CXZZBS2019103)，國家自然科學基金 (Nos. 31171472, 31871548) 資助。

2019-06-28

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20190628.1330.001.html

麻楠, 喬金柱, 湯文倩, 等. 小麥翻譯控制腫瘤蛋白TCTP與蔗糖非酵解型蛋白激酶SnRK1的相互作用. 生物工程學報, 2019, 35(9): 1686–1697.

Ma N, Qiao JZ, Tang WQ, et al. Interaction between wheat translationally controlled tumor protein TCTP and SNF1-related protein kinase SnRK1. Chin J Biotech, 2019, 35(9): 1686–1697.

(本文責編 陳宏宇)