異源表達古菌TRAM基因增強水稻的耐旱性

陳巍，李華麗，邱金龍

異源表達古菌TRAM基因增強水稻的耐旱性

陳巍1, 2，李華麗1，邱金龍1

1 中國科學院微生物研究所，北京 100101 2 中國科學院大學，北京 100049

干旱會直接影響水稻的生長發育，導致其產量和品質下降。在水稻中異源表達細菌RNA分子伴侶Csp能夠顯著提高水稻的耐旱能力，并且不影響水稻的正常生長。古菌中也發現具有類似細菌分子伴侶Csp功能的TRAM (TRM2 and MiaB) 蛋白，且古菌的DNA復制、轉錄和翻譯等過程與真核生物有著更為相似的調控方式，然而，古菌中RNA分子伴侶蛋白能否調控植物耐旱能力還未見報道。我們選取了嗜冷甲烷古菌R15中兩個TRAM蛋白在水稻中進行研究，發現在水稻中過量表達Mpsy_3066和Mpsy_0643兩個TRAM蛋白均能顯著提高水稻苗期和成株期時對干旱脅迫的耐受能力。同時，我們在水稻原生質體中驗證了TRAM蛋白可以發揮其分子伴侶的功能消除RNA的錯誤折疊對翻譯的影響，這可能是TRAM轉基因植物發揮其耐旱能力的作用機制。該工作初步展示了異源表達古菌TRAMs可以作為提高水稻耐旱能力的一種有效手段。

水稻，干旱脅迫，RNA分子伴侶，古菌，TRAM

水稻是世界上最重要的糧食作物之一，為世界上超過一半的人口提供了主糧[1]。然而水稻的生長發育需要大量的水分供給，干旱或者供水不足會對水稻的產量和品質產生巨大的影響[2]。特別是近年來全球氣候變暖，年降水量不穩定且分布不均，對農業用水特別是水稻等農作物的灌溉用水造成了一定的壓力，威脅著糧食安全[3]。因此，提高水稻的抗旱能力是促進糧食增產的一個有效途徑。植物在干旱脅迫下會發生一系列的生理應激反應，包括氣孔開度變化、胞內活性氧清除酶的合成、滲透調節小分子物質(例如可溶性糖、甘氨酸、脯氨酸) 的積累、葉片卷曲以及葉表面角質層加厚等[4]。基于基因工程的方法將干旱脅迫相關基因編輯使之功能失活或向植物基因組中導入外源基因以得到穩定表達的植株，也可增強植物抵抗干旱脅迫的耐受性[5]。

轉錄后水平的基因表達調控對真核生物的生長發育和響應外部環境刺激至關重要[6-8]。RNA分子伴侶(RNA chaperone) 是一類廣泛存在于動物、植物和微生物中的RNA結合蛋白。RNA分子伴侶通過與非功能性折疊的RNA底物結合，幫助其重排并形成正確的折疊方式或幫助RNase降解錯誤折疊的RNA，完成正常的RNA代謝過程[9]。在應激狀態下，一些RNA分子伴侶的表達量會顯著增加，以此來幫助生物體更好地應對脅迫[10-11]。在水稻和玉米中表達細菌中的RNA分子伴侶蛋白——冷激蛋白(Cold shock protein，Csp) CspA和CspB，可以有效地提高其抗凍、抗旱以及抗高溫的能力[12]。在擬南芥和小麥中表達密碼子優化的CspA和CspB蛋白，也可以提高它們的抵抗干旱和鹽脅迫的能力[13]。在水稻中過表達擬南芥RNA伴侶蛋白GRP2和GRP7同樣可以顯著提高干旱條件下水稻的結實率，從而提高水稻的產量[14]。DEAD-box RNA解旋酶(DEAD-box RHs) 家族成員也具有RNA分子伴侶活性，擬南芥中該家族成員RH8通過與PP2CA互作，對ABA信號和干旱脅迫反應具有重要的調節作用[15]。

古菌作為生物學分類中一個龐大的分支，其RNA分子伴侶蛋白對植物耐旱能力的調控卻沒有報道。在古菌DNA的復制、轉錄和翻譯過程中，都可以看到與真核生物更為類似的蛋白結構和調控方式[16]，且古菌多在極端環境下生存，其本身即具有更強的耐受性。因此，我們希望在古菌中找到類似細菌冷激蛋白的RNA分子伴侶，檢測其是否能使植物具有更好的耐受干旱脅迫的能力。雖然Csp類冷激蛋白在細菌中分布廣泛，且在同一物種中含有多個同源蛋白，在古菌中卻鮮有其分布[17]。有趣的是，在古菌中存在一類與冷激蛋白結構類似的蛋白TRAM (TRM2 and MiaB)。TRAM是一類具有RNA結合功能的相關結構域的總稱，包括尿嘧啶甲基化酶TRM2和腺嘌呤硫醇化酶MiaB，這類結構域在包括古菌在內的多種生物體中普遍存在[18]。TRAM蛋白的三維結構已解析，其由5個反向平行的β鏈組成寡核苷酸/寡糖結合折痕區域(Oligonucleotide/oligosaccharide binding fold，OB-fold)，OB-fold結構域一般由70–150個氨基酸組成，通常被認為與核酸識別有關，該結構域家族成員之間序列相似性很低，卻具有多個相似的結構[19]。Csp類蛋白也是由類似結構域組成且與TRAM具有結構同源性。體內和體外的實驗證明，TRAM蛋白同細菌中Csp蛋白功能相似，可以回補大腸桿菌突變體的冷敏感性。TRAM蛋白與底物RNA的結合無明顯序列特異性，且親和能力在微摩爾級別，這與RNA分子伴侶蛋白相符合，進一步說明其可能就是存在于古菌中的RNA分子伴侶蛋白[10]。

我們從已知的嗜冷甲烷古菌(R15) 4個TRAMs基因中選取了2個可以顯著改善大腸桿菌突變體冷敏感性的TRAM基因和，分別在水稻中進行過量表達，檢測了其對水稻耐受干旱脅迫的影響，并初步探究了其作用機制。

1 材料與方法

1.1 水稻轉基因載體的構建及轉化

在 GenBank 數據庫中分別獲取噬冷甲烷古菌(M. psychrophilus R15) 中兩個TRAM蛋白Mpsy_3066 (AFV25265) 和Mpsy_0643 (AFV22852) 的氨基酸序列，參考水稻密碼子偏好性，由南京金斯瑞公司對其進行密碼子優化并合成相應編碼DNA序列。分別將該序列通過SpeⅠ和KpnⅠ酶切位點克隆到雙元表達載體pCAMBIA2300-Ubi[20]中，以玉米泛素啟動子驅動目的基因的表達，構建的載體命名為pC2300-Mpsy-3066和pC2300- Mpsy-0643。電激法將構建好的載體轉入農桿菌AGL1中，利用農桿菌轉化日本晴水稻(L. ssp.c.v. Nipponbare) 愈傷組織，并在含有 G418 的篩選培養基上篩選得到陽性轉基因植物。以上雙元表達載體由中國科學院遺傳與發育研究所儲成才研究員提供，根癌農桿菌菌株AGL1及日本晴野生型水稻由本實驗室保存。

1.2 轉基因植株的鑒定

取培養14 d的水稻新鮮葉片，在液氮中冷凍后破碎，用CTAB法提取水稻基因組DNA。設計引物(表1) 用于插入DNA的擴增檢測，由華大基因合成，稀釋至10 μmol/L。PCR反應采用2×PCR StarMix with Loading Dye試劑盒(康潤公司)。反應體系包括10 μL 2×PCR StarMix、正向及反向引物各1 μL、1 μL DNA提取物和7 μL ddH2O。PCR反應條件為：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個循環；72 ℃ 3 min。

1.3 轉基因植物材料中目的基因的表達分析

取生長14 d的新鮮水稻葉片，迅速加入液氮研磨，使用TRNzol提取試劑盒(天根公司) 提取總RNA。RNA樣品反轉錄采用Maxima H Minus First Strand cDNA合成試劑盒(Thermo公司)。半定量PCR引物設計(表1) 位于檢測基因的3?端。PCR反應前先將反轉產物稀釋5倍，半定量PCR反應體系為10×緩沖液2.5 μL，dNTPs 2 μL，正向及反向引物(10 μmol/L) 各1 μL，cDNA稀釋產物5 μL，酶0.5 μL，ddH2O補足至25 μL。半定量PCR反應條件為：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，28個循環；72 ℃ 3 min。以水稻基因表達作為內參。

表1 引物序列

1.4 水稻幼苗對PEG和脫水的敏感性分析

選取籽粒飽滿、大小均一的水稻種子。水稻種子經75%酒精消毒1 min，用2.5%次氯酸鈉(有效氯含量) 消毒0.5 h后，移至1/2 MS固體培養基上培養。4 d大的水稻苗轉移至含有25%的PEG 6000的1/2 MS固體培養基上繼續生長，9 d后移到營養液中回復培養2 d后拍照。脫水處理：將消毒后的種子放入37 ℃培養箱中水培催芽24 h，萌發后移入營養液中繼續培養，取培養14 d的水稻幼苗至吸水濾紙上干旱處理9.5?10 h，重新復水10 d后拍照。該實驗包含3次生物學重復。

1.5 水稻植株干旱處理及分析

消毒后的種子放入37 ℃培養箱中水培催芽24 h，后移入光照培養箱中營養液培養。培養箱生長條件為光周期為13 h光照/11 h黑暗，光照時溫度為28 ℃，黑暗時溫度為25 ℃。水培一周的小苗移入營養土中，營養土配比為花卉營養土與黃土1∶1，土壤培養溫度及光周期條件不變。待植物長到四葉期后，干旱處理7 d，復水10 d后拍照。該實驗包含3次生物學重復，所呈現實驗結果為3次重復實驗的代表結果。

1.6 原生質體瞬時表達載體的構建

水稻原生質體瞬時表達載體pJIT163-Ubi由中國科學院遺傳與發育研究所高彩霞研究員提供。Mpsy_3066和Mpsy_0643密碼子優化的序列通過d Ⅲ和GⅠ酶切位點分別克隆到pJIT163-Ubi載體中，新構建的載體命名為pJIT163-Mpsy-3066和pJIT163-Mpsy-0643。pJIT163-TrpL-mCherry的TrpL強終止子序列通過引物(表1) 合成直接插入到d Ⅲ和HⅠ 酶切位點之間，即mCherry表達框之前，GFP Y67L表達載體通過引物(表1) 擴增直接引入點突變，新構建的質粒為pJIT163-GFP Y67L。質粒中量提取參考Promega試劑盒Wizard?Midipreps DNA Purification System，調整質粒濃度至1 000 ng/μL。

1.7 水稻原生質體轉化及熒光觀察和流式細胞分析

原生質體制備及轉化主要參考Zhang等[21]的方法并進行了一定改進，水稻MS培養基配制時添加了肌醇(0.1 g/L)，水稻幼苗在黑暗條件下生長得到無菌黃化苗。原生質體轉化過程中pJIT163-mCherry、pJIT163-TrpL-mCherry質粒的轉化量均為500 ng。用于轉化后熒光觀察的原生質體移入含2 mL WI溶液的35 mm培養皿中孵育。用于轉化后流式細胞儀檢測的原生質體，置于含200 μL WI溶液的流式管中孵育，轉化48 h后進行熒光觀察或流式細胞分析。該實驗包含2次生物學重復，所呈現實驗結果為該重復實驗的代表結果。

2 結果與分析

2.1 古菌TRAM編碼基因轉基因水稻的獲得及表達分析

我們對噬冷甲烷古菌R15中兩個TRAM蛋白的編碼基因和進行了密碼子優化，通過農桿菌介導的方法獲得了異源表達TRAM的轉基因水稻。為了驗證TRAMs在水稻中是否正常表達，我們用半定量PCR的方法對不同轉基因陽性株系中和基因的表達水平進行檢測(圖1)。挑選過表達株系進行傳代，獲得T2代轉基因純合體，對其進行擴繁并用于進一步的實驗。

圖1 不同轉基因水稻株系中TRAM的基因表達水平

2.2 異源表達TRAM增強水稻幼苗耐旱能力

為了檢測異源表達TRAM是否改變水稻的耐旱能力，我們首先利用PEG模擬干旱處理，檢測水稻幼苗的生長情況。我們將4 d大的野生型和各轉基因株系水稻幼苗轉移至含有25% PEG6000的培養基或正常培養基上繼續生長9 d。結果發現，在沒有PEG脅迫處理的情況下，野生型和轉基因幼苗生長沒有明顯區別(圖2A、2B)；而在PEG處理后，相比于野生型，轉基因幼苗的株高均有不同程度的提高(圖2C、2D)。

圖2 野生型及TRAM轉基因水稻幼苗對PEG處理敏感性的分析

同時，我們檢測了短期脫水對水稻苗期存活率的影響。我們將在培養液中生長14 d的幼苗置于濾紙上脫水處理9.5 h，復水10 d后統計水稻存活率。結果表明，轉基因水稻幼苗存活率明顯好于野生型(圖3A、3B)，表明異源表達TRAM可以顯著提高水稻植株對失水的耐受性。

圖3 脫水處理后野生型和轉基因水稻幼苗的存活率

2.3 異源表達TRAM增強水稻植株期耐旱能力

為了檢測水稻植株期耐旱能力，我們將土壤中生長的四葉期水稻植株干旱處理7 d，然后復水10 d，比較野生型和轉基因植物的耐旱能力。結果表明，TRAM轉基因水稻植株的耐旱能力相比于野生型植株明顯提高(圖4)。

2.4 古菌TRAM蛋白在水稻細胞中能夠解鏈RNA二級結構

為了進一步研究古菌TRAM蛋白在植物細胞中可能的作用機制，我們以mCherry作為報告基因構建了抗轉錄終止報告系統，即在mCherry熒光蛋白的正常表達框之前插入了TrpL強終止子序列(圖5A)。這個序列可以在轉錄生成的mRNA上形成雙鏈配對的結構，影響其后mCherry的翻譯過程，降低熒光蛋白表達量。我們將構建的該系統在水稻原生質體中進行表達驗證，發現在引入TrpL序列后，mCherry熒光蛋白表達量明顯下降(圖5B)，證明了這一報告系統的可靠性。

圖4 TRAM轉基因水稻植株耐旱能力增強

圖5 水稻中抗終止報告系統的建立和驗證

基于以上報告系統，我們對轉化后的原生質體樣品進行流式細胞儀檢測并分別統計其熒光強度，結果顯示其熒光強度基本呈正態分布(圖6A)，我們選取轉化pJIT163-mCherry和pJIT163- GFP Y67L質粒的原生質體作為對照，標記其峰面積50%為中間值，以該中間值對應的熒光強度為基準，統計不同轉化樣品高于該熒光強度的峰面積各自所占比例(圖6B)，結合圖6A和6B可以看到共轉化或后，其整體熒光強度相比于共轉化pJIT163-GFP Y67L質粒的熒光強度明顯提高。熒光觀察也進一步驗證了這一結果(圖6C、6D、6E)。以上結果暗示，來自古菌的TRAM蛋白在水稻中可以打開錯誤折疊的RNA二級結構，具有RNA分子伴侶的功能。

3 討論

植物可以通過轉錄及轉錄后調控響應干旱脅迫。一條成熟的mRNA需經過剪接、加帽、多腺苷酸化等一系列過程才能進入細胞質中進行RNA的翻譯。而在RNA的翻譯過程中各種RNA二級結構的錯誤折疊也會影響翻譯的進程，使翻譯變得緩慢或直接停滯。為了更好地完成生命活動，生物體進化出了多種RNA結合蛋白(RNA binding protein，RBPs)來完成轉錄后水平的調控。在干旱脅迫時，由于機體的紊亂和受損，RNA分子伴侶的功能的行使顯得更為重要。

TRAM結構域是一類具有RNA結合活性的多肽片段。在古菌中該結構域單獨存在，直接作為一個功能蛋白發揮著類似于細菌中Csp蛋白RNA分子伴侶的功能，這為TRAM蛋白的開發利用提供了更多的方便性和靈活性。根據已有的報道，細菌中Csp蛋白在植物中異源表達，可以顯著地提高植物耐受干旱的能力。因此，我們推測古菌中的TRAMs蛋白可能同Csp蛋白一樣在植物中過表達可以提高植物耐受干旱的能力。我們通過實驗進一步驗證了這一猜想。在PEG模擬干旱的處理條件下，我們統計了植株地上部分的生長能力。與野生型植物相比，過表達TRAM的水稻幼苗植物地上部分生長能力均有不同程度的提高；在對苗期植物脫水處理后復水，水稻幼苗存活率有15%?20%的提高。同時，我們進一步驗證了水稻成株期時耐受干旱脅迫的能力，在干旱處理7 d后，野生型植株在復水后枯死較多，而異源表達TRAM的水稻植株仍有半數以上可以繼續生長，證明了轉基因組水稻植株在成株期的耐旱能力也有所提升。這些結果都支持異源表達TRAM可以提高水稻耐受干旱脅迫的能力。

圖6 古菌TRAM在水稻原生質體中對RNA二級結構的解鏈活性

目前，雖然有大量的文獻報道了通過改造植物內源基因或表達異源基因來提高植物抗旱的能力，但是一些基因在提高水稻抗旱能力的同時會影響水稻的生長。例如，由CaMV 35S啟動子過表達的一些轉錄因子(如DREB) 會導致植物生長緩慢，進而導致產量下降[22]。AtRZ-1a過表達擬南芥植株與野生型相比，表現出種子萌發遲緩和幼苗生長變慢的表型。有趣的是，過表達古菌TRAM的水稻植株沒有表現出明顯的植物營養生長的差異，進一步支持了該類基因在水稻抗旱性遺傳改良中的利用價值。

對于TRAM蛋白在植物細胞中可能的作用機制，我們發現TRAM蛋白在植物細胞中具有促進錯誤折疊的RNA結構改變而抗終止的功能，進一步證明了古菌TRAMs發揮RNA分子伴侶的功能。我們推測TRAM在水稻中也是利用其RNA分子伴侶的功能，在干旱脅迫條件下消除RNA二級結構的錯誤折疊對蛋白翻譯的影響，從而保證機體代謝的正常進行。

在分子水平上，古菌和真核生物相比有更多的相似之處。古菌在轉錄、翻譯及蛋白降解系統的組成元件上，都表現出明顯的真核特征[16]。如，古菌中RNA聚合酶比細菌中復雜的多，而且它們的亞基組成與真核生物相似[23]；又如，核糖體的三維結構也預示真核生物可能與泉古菌門在進化上的聯系[24]。阿斯加德古菌的發現進一步深化了人們對古菌和真核生物關系的認識[25-26]。古菌作為生物學分類中一個龐大的分支，來自于古菌更多的分子元件、代謝產物有待我們開發，相信也將在植物基因工程改造上或者在更大范圍獲得更好的利用。

總之，本研究闡明了異源表達古菌TRAM基因可以提高水稻耐受干旱的能力，TRAM蛋白在植物細胞中發揮功能可能是通過打開錯誤配對的二級結構以穩定RNA的正常代謝。本研究也為開發利用古菌中多樣的分子資源提供了參考。

致 謝 感謝中國科學院微生物研究所東秀珠研究員為我們提供TRAM的相關信息及材料。

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Ectopic expression of archaeal TRAM-encoding genes in rice improves its drought-tolerance

Wei Chen1, 2, Huali Li1, and Jinlong Qiu1

1 Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China 2 University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China

Drought stress affects the growth and development of rice, resulting in severe loss in yield and quality. Ectopic expression of the bacterial RNA chaperone, cold shock protein (Csp), can improve rice drought tolerance. Archaeal TRAM (TRM2 and MiaB) proteins have similar structure and biochemical functions as bacterial Csp. Moreover, DNA replication, transcription and translation of archaea are more similar to those in eukaryotes. To test if archaeal RNA chaperones could confer plant drought tolerance, we selected two TRAM proteins, Mpsy_3066 and Mpsy_0643, from a cold-adaptive methanogenic archaeaR15 to study. We overexpressed the TRAM proteins in rice and performed drought treatment at seedling and adult stage. The results showed that overexpression both TRAM proteins could significantly improve the tolerance of rice to drought stress. We further demonstrated in rice protoplasts that the TRAMs could abolish misfolded RNA secondary structure and improve translation efficiency, which might explain how TRAMs improve drought tolerance transgenic rice. Our work supports that ectopic expression of archaeal TRAMs effectively improve drought tolerance in rice.

rice, drought stress, RNA chaperon, archaea, TRAM

March 5, 2019;

March 28, 2019

Jinlong Qiu. Tel/ Fax: +86-10-64807398; E-mail:qiujl@im.ac.cn

2019-04-09

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20190408.1036.001.html

陳巍, 李華麗, 邱金龍. 異源表達古菌TRAM基因增強水稻的耐旱性. 生物工程學報, 2019, 35(9): 1676–1685.

Chen W, Li HL, Qiu JL. Ectopic expression of archaeal TRAM-encoding genes in rice improves its drought-tolerance. Chin J Biotech, 2019, 35(9): 1676–1685.

(本文責編 陳宏宇)